【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型多肽
[0001]本专利技术涉及具有新结构格式的双特异性抗体，其对两种靶抗原具有特异性，并且包括免疫球蛋白和Fab。在所述双特异性抗体中，所述Fab通过所述Fab的轻链附加至所述免疫球蛋白的重链的C端末端。本专利技术还提供了一种多肽，其包括抗原结合片段，所述抗原结合片段具有促进重链与轻链缔合的特定突变。
技术介绍
[0002]癌症是发达国家过早死亡的主要原因。癌症的免疫疗法旨在对肿瘤细胞产生有效的免疫反应。这可以通过例如打破对肿瘤抗原的耐受性、增强抗肿瘤免疫反应和刺激肿瘤部位的局部细胞因子反应来实现。持久抗肿瘤免疫反应的关键效应细胞是活化的肿瘤特异性效应T细胞。活化的效应T细胞的有效扩增可以将免疫反应重定向到肿瘤。在这种情况下，调节性T细胞(Treg)在抑制抗肿瘤免疫中发挥作用。因此，耗竭、抑制、恢复或灭活Treg可以提供抗肿瘤作用并恢复肿瘤微环境中的免疫抑制。进一步地，例如，树突状细胞对效应T细胞的不完全活化会导致T细胞无反应性，从而导致抗肿瘤反应效率低下，而树突状细胞的充分诱导可以产生活化的效应T细胞的有效扩增，从而将免疫反应重定向到肿瘤。此外，自然杀伤(NK)细胞通过攻击人类白细胞抗原(HLA)表达下调的肿瘤细胞并通过诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而在肿瘤免疫学中发挥重要作用。因此，刺激NK细胞也可以减少肿瘤的生长。
[0003]双特异性抗体可用于癌症治疗，因为它们允许双重靶向细胞。例如，双特异性抗体可能能够活化肿瘤细胞附近的宿主免疫细胞，因此可以替代现有的仅靶向一种抗原的单特异性药物。>[0004]与单克隆抗体相比，双特异性抗体更难产生。已经专利技术了许多不同的格式，并且所有格式都具有不同的优势和局限性。不存在适用于任何应用的格式。
[0005]设计的格式数量众多，并且可以根据格式的一般架构对其进行分组。Brinkmann和Kontermann提出了19个组的分类(参见Brinkmann和Kontermann,2017,《mAbs》9:182
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212)。各组之间的主要区别在于它们的对称性、它们的目标化合价、它们的组分以及它们的位置。
[0006]对于不同的双特异性格式组，通常承认不同的性质。缺乏Fc部分的基于片段的格式具有有限的半衰期，并且不能介导Fc效应子功能。IgG样格式仅显示与每个靶标的单价结合。
[0007]制造携带一条以上重链和一条轻链的双特异性抗体时，一项主要的生物加工挑战是链的错配(参见Krah等人,2018,《抗体(Antibodies)》,7)。对于IgG样双特异性抗体，这通常被称为轻链错配。已经报道了几种突变策略来促进正确的重链和轻链配对(参见Lewis等人,2014,《自然生物技术(Nat Biotechnol)》,32:191
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8；Liu等人,2015,《生物化学杂志(J Biol Chem)》,290:7535
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62；Mazor等人,2015,《mAbs》,7:377
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89；Golay等人,2016,《免疫学杂志(J Immunol)》,196:3199
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211；等人,2017,《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng Des Sel)》,30:658
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96)。
[0008]此外，对于不同的双特异性格式组，通常承认其它性质。缺乏Fc部分的基于片段的格式具有有限的半衰期，并且不能介导Fc效应子功能。具有单链片段(scFv)的格式可能稳定性较差。IgG样格式仅显示与每个靶标的单价结合。
[0009]需要一种即插即用(plug
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and
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play)的四价格式，所述格式携带Fc结构域，并且不会产生轻链错配的构建体。
技术实现思路
[0010]以下专利技术提供了一种新的双特异性抗体格式。本专利技术是由偶联至一个或多个Fab片段的免疫球蛋白组成的格式，二者任选地通过多肽接头连接。所述免疫球蛋白和Fab片段通过所述免疫球蛋白的C端末端和所述Fab片段的轻链的N端末端连接(参见，例如，图1)。因此，构建体将由三个独立的链组成，1)由免疫球蛋白重链和另外的Fab片段的轻链组成的长链，2)与免疫球蛋白部分的VH和CH1结构域结合的轻链，以及3)与附加至所述免疫球蛋白的轻链结合的短重链。
[0011]本专利技术还提供了一种包括抗原结合片段的多肽，
[0012]其中所述抗原结合片段包括抗体VL区和抗体VH区，
[0013]其中所述抗原结合片段包括四个或更多个突变以促进重链与轻链的缔合，
[0014]其中所述VL区在位置44处包括突变(根据IMGT编号)，
[0015]并且其中所述VH区在位置44处包括突变(根据IMGT编号。专利技术人已经令人惊讶地鉴定，此类抗体特别稳定，并且可以以最小的错配形成。
[0016]VH
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CH1和VL
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Cκ(或VL
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Cλ)之间的突变被引入到本专利技术的双特异性抗体中。这些突变产生的表面限制了聚集体和副产物Fab片段的形成。例如，突变会导致错误链的空间位阻或电荷不相容性，或促进正确链之间的相互作用，例如通过产生盐或二硫桥。作为本专利技术的一部分，专利技术人已经发现了一些促进稳定性、结合和可制造性的特定突变组合，并且无法预测哪种突变组合将是最有益的。
[0017]新专利技术最重要的优势之一是所述格式的即插即用能力，这在双特异性格式中并不常见。这部分地归因于使用了Fab片段而不是scFv，这提供了稳定性并降低了必须执行冗长的线索优化活动的风险。此外，权利要求书的一个实施例的双特异性抗体的四价架构提供了亲合力效应并降低了必须使抗体亲和成熟的风险。此外，本专利技术提供了一种携带在天然抗体中发现的Fc部分的所有结构域的格式，其允许使用标准的CMC纯化方法(如使用蛋白质A)和更长的体内半衰期。Fc部分还将允许通过变体Fc区的存在来调节生物学功能，所述生物学功能包含抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
[0018]在本专利技术中，所述Fab片段以比其它格式具有多种优势的方式与所述免疫球蛋白连接。例如，由于所述Fab附加到所述Fc部分(所谓的C端末端)，而不是在免疫球蛋白结合结构域的顶部，因此没有观察到导致亲和力降低的空间位阻。此外，由于所述Fab片段通过其轻链附加，因此不会发生轻链错配。这是一个非常有价值的特征，因为轻链错配会导致药物效力的严重变化并且难以分析，并且在CMC制造过程中很难去除错配的副产物。
具体实施方式
[0019]本专利技术的第一方面提供了一种双特异性抗体，其包括：
[0020](a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包括第一重链多肽和第一轻链多肽；以及
[0021](b)对第二抗原具有特异性的至少一个Fab片段，所述Fab片段包括第二重链多肽和第二轻链多肽
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，其包括抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括抗体VL区和抗体VH区，其中所述抗原结合片段包括四个或更多个促进重链与轻链缔合的突变，其中所述VL区在位置44处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中所述VH区在位置44处包括突变(根据IMGT编号)。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv片段(如单链Fv片段或二硫键结合的Fv片段)、Fab样片段(如Fab片段；Fab'片段或F(ab)2片段)和结构域抗体。3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是免疫球蛋白分子。4.根据权利要求3所述的多肽，其进一步包括一个或多个突变，所述一个或多个突变位于以下一个或多个区域中：(i)所述CH1区和/或(ii)所述Cκ或Cλ区。5.根据权利要求3或4所述的多肽，其中所述CH1区在位置168和/或位置170处包括突变(根据EU编号)；并且其中所述Cκ或Cλ区在位置135和/或位置176处包括突变(根据卡巴特编号)。6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中位置44处的所述VL区突变在位置Q44处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中位置44处的所述VH区突变在位置Q44处包括突变(根据IMGT编号)。7.根据权利要求6所述的多肽，其中位置Q44处的所述VL区突变在位置Q44E、Q44D、Q44R或Q44K处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中位置Q44处的所述VH区突变在位置Q44R、Q44K、Q44E或Q44D处包括突变(根据IMGT编号)。8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述抗原结合片段在选自由以下组成的列表的位置处包括两个或更多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述VL区在选自由以下组成的列表的位置处包括一个或多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。10.根据权利要求8所述的多肽，其中所述VH区在选自由以下组成的列表的位置处包括一个或多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。11.根据权利要求8到10中任一项所述的多肽，其中所述两个或更多个突变是选自由以下组成的列表的位置：Q44、G49、A49、Q120和A120(根据IMGT编号)。12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述两个或更多个突变是选自由以下组成的列表的位置：Q44E、Q44R、Q44K、G49C、A49D、Q120C、A120C和Q120K(根据IMGT编号)。13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述突变防止聚集体和Fab副产物的形成。14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成聚集体。15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成Fab副产物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括一个或多个突变对，每个突变对包括两个功能相容的突变。17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述功能相容的突变选自：(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)双重带电突变；和/或(e)导致形成二硫桥的突变。18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述多肽在以下一个或多个区域组中包括一个或多个突变对：(a)CH1和Cκ或Cλ区；和/或(b)VL和VH区。19.根据权利要求18所述的多肽，其中所述CH1和Cκ或Cλ区中的突变对选自：(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)导致形成二硫桥的突变。20.根据权利要求17到19中任一项所述的多肽，其中所述突变对位于VH和VL区中，并且其中所述突变对选自：(a)带电突变(即盐突变)；和/或(b)双重带电突变；和/或(c)导致形成二硫桥的突变。21.根据权利要求18到20所述的多肽，其中所述多肽包括选自以下的一个或多个突变对：(a)CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变；(b)CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变以及VH和VL区中的盐突变；(c)CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变；(d)CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变以及VH和VL区中的盐突变；(e)CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变以及VH和VL区中的盐突变。22.根据权利要求4到21中任一项所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的组的位置处：(a)CH1结构域中的以下一个或多个位置：H168、F170、L145、S183和T187(根据EU编号)；和/或(b)选自Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个位置范围的位置：位置132到138、位置173到179、位置130到136、位置111到117和位置134到140(根据卡巴特编号)。23.根据权利要求4到22中任一项所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的组的位置处：(a)CH1结构域中的以下一个或多个位置：H168、F170、L145、S183和T187(根据EU编号)；和/或
(b)Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个位置：L135、S176、V133、S114和N137(根据卡巴特编号)。24.根据权利要求4到23中任一项所述的多肽，其中所述突变选自由以下组成的组：(a)CH1结构域中的以下一个或多个突变：H168A、F170G、L145Q、S183V和T187E(根据EU编号)；和/或(b)Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个突变：L135Y、S176W、V133T、S176V、S114A和N137K(根据卡巴特编号)。25.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是双特异性抗体。26.根据权利要求26所述的多肽，其中所述多肽是包括至少两个抗原结合片段的免疫球蛋白分子，其中第一抗原结合片段对第一抗原具有特异性，而第二抗原结合片段对第二抗原具有特异性，优选地其中所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段是第一Fab和第二Fab。27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述双特异性抗体包括(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包括第一重链多肽和第一轻链多肽；以及(b)对第二抗原具有特异性的至少一个Fab片段，所述Fab片段包括第二重链多肽和第二轻链多肽其中所述第二轻链多肽融合至所述第一重链多肽的C端并且其中所述双特异性抗体包括一个或多个突变以促进所述第一重链多肽与所述第一轻链多肽的缔合和/或促进所述第二重链多肽与所述第二轻链多肽的缔合。28.根据权利要求3到27中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白分子包括所述第一重链多肽的两个拷贝和/或所述第一轻链多肽的两个拷贝。29.根据权利要求27或28所述的多肽，其中所述抗体包括根据(b)的两个Fab片段。30.根据权利要求27到29中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白分子包括所述第一重链多肽的两个拷贝和所述第一轻链多肽的两个拷贝，并且所述双特异性抗体进一步包括根据(b)的两个Fab片段，并且第一Fab片段通过所述Fab片段的轻链多肽融合至所述第一重链多肽的第一拷贝的C端；并且第二Fab片段通过所述Fab片段的轻链多肽融合至所述第一重链多肽的第二拷贝的C端。31.根据权利要求3到30中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白分子包括人Fc区或所述区域的变体，其中所述区域为IgG1区、IgG2区、IgG3区或IgG4区，优选为IgG1区或IgG4区。32.根据权利要求31所述的多肽，其中所述Fc区是天然存在的(即野生型)人Fc区。33.根据权利要求31所述的多肽，其中所述Fc区是非天然存在的(例如突变的)人Fc区。34.根据权利要求31到33中任一项所述的多肽，其中所述Fc区具有经修饰的糖基化，例如其中所述Fc区是无岩藻糖基化的。35.根据权利要求27到34中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个突变位于以下一个或多个区域中：
(i)第一重链多肽的CH1区和/或(ii)第二重链多肽的CH1区和/或(iii)第二重链多肽的VH区，和/或(iv)第一轻链多肽的Cκ或Cλ区和/或(v)第二轻链多肽的Cκ或Cλ区和/或(vi)第二轻链多肽的VL区。36.根据权利要求27到35中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个突变防止所述第二重链多肽与所述第一轻链多肽的结合和/或防止与所述第二轻链多肽融合的所述第一重链多肽的自聚集。37.根据权利要求27到35中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个突变防止聚集体和Fab副产物的形成。38.根据权利要求27到37中任一项所述的多肽，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成聚集体。39.根据权利要求27到38中任一项所述的多肽，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成Fab副产物。40.根据权利要求27到39中任一项所述的多肽，其中所述抗体包括一个或多个突变对，每个突变对包括两个功能相容的突变。41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述功能相容的突变选自：(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)双重带电突变；和/或(e)导致形成二硫桥的突变。42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述双特异性抗体在以下一个或多个区域组中包括一个或多个突变对：(a)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区；和/或(b)Fab的CH1和Cκ或Cλ区；和/或(c)免疫球蛋白的VL和VH区；和/或(d)Fab的VL和VH区。43.根据权利要求42所述的多肽，其中所述突变对位于Fab和/或免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中，并且其中所述突变对选自：(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)导致形成二硫桥的突变。44.根据权利要求41到43中任一项所述的多肽，其中所述突变对位于Fab的VH和VL区中，并且其中所述突变对选自：(a)带电突变(即盐突变)；和/或(b)双重带电突变；和/或
(c)导致形成二硫桥的突变。45.根据权利要求41到44中任一项所述的多肽，其中所述双特异性抗体包括选自以下的一个或多个突变对：(a)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变；(b)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(c)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(d)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变以及Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变；(e)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(f)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(g)Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的二硫桥形成性突变；(h)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(i)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(j)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(k)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的盐突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(l)免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(m)免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(n)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变和盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；(o)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变和盐突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变；(p)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变和盐突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变；或(q)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变和盐突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1和Cκ或Cλ区中的疏水突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变和二硫桥形成性突变。(r)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变、Fab的CH1中的盐突变和Cκ或Cλ区中的丙氨酸突变以及Fab的VH和VL区中的盐突变。46.根据权利要求27到45中任一项所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的
组的位置处：(a)CH1结构域中的以下一个或多个位置：H168、F170、L145、S183和T187(根据EU编号)；和/或(b)选自Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个位置范围的位置：位置132到138、位置173到179、位置130到136、位置111到117和位置134到140(根据卡巴特编号)；和/或(c)选自VL中的以下一个或多个位置范围的位置：位置41到47、位置117到123和位置46到52(根据IMGT编号)；和/或(d)选自VH中的以下一个或多个位置范围的位置：位置41到47、位置46到52和位置117到123(根据IMGT编号)。47.根据权利要求27到46中任一项所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的组的位置处：(a)CH1结构域中的以下一个或多个位置：H168、F170、L145、S183和T187(根据EU编号)；和/或(b)Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个位置：135、176、133、114和137(根据卡巴特编号)；和/或(c)VL中的以下一个或多个位置：44、120和49(根据IMGT编号)；和/或(d)VH中的以下一个或多个位置：44、49和120(根据IMGT编号)。48.根据权利要求27到47中任一项所述的多肽，其中所述突变位于选自由以下组成的组的位置处：(a)CH1结构域中的以下一个或多个位置：H168、F170、L145、S183和T187(根据EU编号)；和/或(b)Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个位置：L135、S176、V133、S114和N137(根据卡巴特编号)；和/或(c)VL中的以下一个或多个位置：Q44、Q120或A120和A49(根据IMGT编号)；和/或(d)VH中的以下一个或多个位置：Q44、G49和Q120(根据IMGT编号)。49.根据权利要求48所述的多肽抗体，其中所述突变选自由以下组成的组：(a)CH1结构域中的以下一个或多个突变：H168A、F170G、L145Q、S183V和T187E(根据EU编号)；和/或(b)Cκ或Cλ结构域中的以下一个或多个突变：L135Y、S176W、V133T、S176V、S114A和N137K(根据卡巴特编号)；和/或(c)VL中的以下一个或多个突变：Q44R、Q44K、Q44E、Q120C或A120C、Q44D和A49D(根据IMGT编号)；和/或(d)VH中的以下一个或多个突变：Q44E、Q44R、G49C、Q44K、Q44D、Q120C和Q120K(根据IMGT编号)。50.一种双特异性抗体，其包括：(a)对第一抗原具有特异性的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包括第一重链多肽和第一轻链多肽；以及(b)对第二抗原具有特异性的至少一个Fab片段，所述Fab片段包括第二重链多肽和第二轻链多肽
其中所述第二轻链多肽融合至所述第一重链多肽的C端并且其中所述双特异性抗体包括一个或多个突变以促进所述第一重链多肽与所述第一轻链多肽的缔合和/或促进所述第二重链多肽与所述第二轻链多肽的缔合。51.根据权利要求50所述的双特异性抗体，其中(a)包括对第一抗原具有特异性的一个或多个抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括抗体VL区和抗体VH区，其中所述抗原结合片段包括四个或更多个突变，其中所述VL区在位置44处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中所述VH区在位置44处包括突变(根据IMGT编号)。52.根据权利要求50或51所述的多肽，其中(a)包括(i)所述CH1区和/或(ii)所述Cκ或Cλ区；并且其中所述CH1区在位置168和/或位置170处包括突变(根据EU编号)；并且其中所述Cκ或Cλ区在位置135和/或位置176处包括突变(根据卡巴特编号)；其中(b)包括(i)所述CH1区和/或(ii)所述Cκ或Cλ区；并且其中所述CH1区在位置187处包括突变；并且其中所述Cκ或Cλ区在位置114和/或位置137处包括突变(根据卡巴特编号)。53.根据权利要求51或52所述的双特异性抗体，其中位置44处的所述VL区突变在位置Q44处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中位置44处的所述VH区突变在位置Q44处包括突变(根据IMGT编号)。54.根据权利要求51到53中任一项所述的双特异性抗体，其中位置Q44处的所述VL区突变在位置Q44R、Q44K Q44E或Q44D处包括突变(根据IMGT编号)，并且其中位置Q44处的所述VH区突变在位置Q44R或Q44K处包括突变(根据IMGT编号)。55.根据权利要求51到54中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗原结合片段在选自由以下组成的列表的位置处包括两个或更多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。56.根据权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述VL区在选自由以下组成的列表的位置处包括一个或多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。57.根据权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述VH区在选自由以下组成的列表的位置处包括一个或多个突变：44、49和120(根据IMGT编号)。58.根据权利要求55到57中任一项所述的双特异性抗体，其中所述两个或更多个突变是选自由以下组成的列表的位置：Q44、G49、A49和Q120(根据IMGT编号)。59.根据权利要求58所述的双特异性抗体，其中所述两个或更多个突变是选自由以下组成的列表的位置：Q44E、Q44R、Q44K、Q44D、G49C、G49D、A49D、A49C、Q120C和Q120K(根据IMGT编号)。60.根据权利要求51到59中任一项所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白分子包括所述第一重链多肽的两个拷贝和/或所述第一轻链多肽的两个拷贝。61.根据权利要求51到60中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体包括根据(b)的
两个Fab片段。62.根据权利要求51到61中任一项所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白分子包括所述第一重链多肽的两个拷贝和所述第一轻链多肽的两个拷贝，并且所述双特异性抗体进一步包括根据(b)的两个Fab片段，并且第一Fab片段通过所述Fab片段的轻链多肽融合至所述第一重链多肽的第一拷贝的C端；并且第二Fab片段通过所述Fab片段的轻链多肽融合至所述第一重链多肽的第二拷贝的C端。63.根据权利要求51到62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白分子包括人Fc区或所述区域的变体，其中所述区域为IgG1区、IgG2区、IgG3区或IgG4区，优选为IgG1区或IgG4区。64.根据权利要求63所述的双特异性抗体，其中所述Fc区是天然存在的(即野生型)人Fc区。65.根据权利要求63所述的双特异性抗体，其中所述Fc区是非天然存在的(例如突变的)人Fc区。66.根据权利要求63到65中任一项所述的双特异性抗体，其中所述Fc区具有经修饰的糖基化，例如其中所述Fc区是无岩藻糖基化的。67.根据权利要求51到66中任一项所述的双特异性抗体，其中所述一个或多个突变位于以下一个或多个区域中：(i)第一重链多肽的CH1区和/或(ii)第一重链多肽的VH区，和/或(iii)第二重链多肽的CH1区和/或(iv)第二重链多肽的VH区，和/或(v)第一轻链多肽的Cκ或Cλ区和/或(vi)第一轻链多肽的VL区，和/或(vii)第二轻链多肽的Cκ或Cλ区，和/或(viii)第二轻链多肽的VL区。68.根据权利要求51到67中任一项所述的双特异性抗体，其中所述一个或多个突变防止所述第二重链多肽与所述第一轻链多肽的结合和/或防止与所述第二轻链多肽融合的所述第一重链多肽的自聚集。69.根据权利要求51到68中任一项所述的双特异性抗体，其中所述一个或多个突变防止聚集体和Fab副产物的形成。70.根据权利要求51到69中任一项所述的双特异性抗体，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成聚集体。71.根据权利要求51到70中任一项所述的双特异性抗体，其中所述突变通过产生空间位阻和/或电荷之间的不相容性来防止形成Fab副产物。72.根据权利要求51到71中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体包括一个或多个突变对，每个突变对包括两个功能相容的突变。73.根据权利要求72所述的双特异性抗体，其中所述功能相容的突变选自：
(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)双重带电突变；和/或(e)导致形成二硫桥的突变。74.根据权利要求73所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在以下一个或多个区域组中包括一个或多个突变对：(a)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区；和/或(b)Fab的CH1和Cκ或Cλ区；和/或(c)免疫球蛋白的VL和VH区；和/或(d)Fab的VL和VH区。75.根据权利要求74所述的双特异性抗体，其中所述突变对位于Fab和/或免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中，并且其中所述突变对选自：(a)空腔和突出表面突变(即空间突变)；和/或(b)疏水交换突变；和/或(c)带电突变(即盐突变)；和/或(d)导致形成二硫桥的突变。76.根据权利要求73到75中任一项所述的双特异性抗体，其中所述突变对位于Fab和/或免疫球蛋白的VH和VL区中，并且其中所述突变对选自：(a)带电突变(即盐突变)；和/或(b)双重带电突变；和/或(c)导致形成二硫桥的突变。77.根据权利要求74到76中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括选自以下的一个或多个突变对：(a)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变；(b)免疫球蛋白的CH1和Cκ或Cλ区中的空间突变、免疫球蛋白的VH和VL区中的盐突变以及...
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