一种邻近生物素连接酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程，进一步的说是基因工程改造的邻近生物素连接酶，具体的说一种用邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。邻近生物素连接酶为生物素连接酶中位于ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近定点插入非天然氨基酸。所得邻近生物素连接酶在未经过特定波长紫外照射或者未与特定化合物孵育时，抑制其邻近生物素连接酶的酶活性。而后对所得邻近生物素连接酶进行特定紫外波长照射或者加入特定化合物，将非天然氨基酸转化为天然氨基酸，恢复其酶活性。本发明专利技术邻近生物素连接酶可以消除以往生物素连接酶的非特异性背景，极大提高鉴定特定细胞器内蛋白质组的特异性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种邻近生物素连接酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程，进一步的说是基因工程改造的邻近生物素连接酶，具体的说一种用邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。

技术介绍

[0002]邻近标记已成为免疫沉淀和传统生化分离的替代方法，通过与蛋白质组学联合使用，已经被广泛用于大分子复合物组分鉴定、细胞器内蛋白质种类分析和蛋白质相互作用网络的构建。邻近标记技术的策略通常为将目的蛋白与邻近标记的酶融合表达，进而将目的蛋白靶向到细胞内特定的位置。通过加入生物素等小分子底物，该邻近标记的酶可以催化与目的蛋白空间位置邻近的蛋白质发生生物素化共价连接修饰，上述被生物素化修饰的蛋白质可以利用耦联链霉亲和素的珠子富集并进一步利用质谱鉴定。
[0003]目前，研究人员成功开发了以下两大类酶用于邻近标记：(1)一类为大肠杆菌生物素连接酶BirA的邻近标记突变体，这其中主要包括BirA
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R118G(本文后面将该蛋白称为BioID)[1,2]和TurboID[3]；(2)另外一类为大豆抗坏血酸过氧化物酶的突变体，这主要包括APEX2[4]。
[0004]APEX2优点为对邻近蛋白的标记速度快，可以在1分钟左右完成，然而，APEX2对邻近蛋白质的生物素标记需要向培养基中添加双氧水(H2O2)，这对活细胞标记具有毒性同时也很难应用到活体组织中。
[0005]BioID优点为以生物素作为底物，无细胞毒性，目前已经有近100余项关于BioID的应用报道。但是，BioID的主要缺点为对邻近蛋白进行生物素标记的至少需要18个小时的反应时间才能积累足够用于质谱鉴定的蛋白质。TurboID与BioID类似，均来源于对大肠杆菌的生物素连接酶的突变，TurboID以生物素为底物，能将标记时间缩短到10分钟。因此，TurboID在哺乳动物细胞及模式生物上得到了广泛的应用[5,6]。
[0006]然而，生物素为大多数哺乳动物细胞生长必须物质，而TurboID与BioID在细胞内表达逐渐积累的过程一般需要12个小时左右，逐渐累积的TurboID和BioID能够利用细胞培养基中的生物素对邻近蛋白产生较高的背景标记，从而影响质谱鉴定的特异性。
[0007]与经典的的密码子不同，琥珀密码子UAG(TAG)在巴氏甲烷八叠球菌和詹氏甲烷球菌中分别可以作为编码吡咯赖氨酸(赖氨酸衍生物)[7]和酪氨酸的有义密码子[8]，而并非终止密码子。通过基因工程改造可以得到与哺乳动物正交的和吡咯烷基
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tRNA合成酶，进而在哺乳动物细胞中将赖氨酸的衍生物或者酪氨酸的衍生物定点插入到目的蛋白中。
[0008]如果能够使邻近生物素连接酶TurboID在积累表达的过程中不具有活性，而在接受物理或者化学的刺激条件下恢复其生物素连接酶的活性，这将有效降低标记背景，提高邻近标记的准确性和特异性，同时保留TurboID的时间和空间分辨率。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的在于一种用光控邻近生物素连接酶进行蛋白质邻近标记及其应用。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
[0011]一种邻近生物素连接酶，邻近生物素连接酶为在生物素连接酶的ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近，定点插入非天然氨基酸。
[0012]所得邻近生物素连接酶在未经过特定波长紫外照射或者未与特定类型化合物孵育时，抑制其邻近生物素连接酶的酶活性。而后对该邻近生物素连接酶进行365纳米照射或者与特定化合物孵育，将非天然氨基酸转化为天然氨基酸，恢复其酶活性。
[0013]所述邻近生物素连接酶为大肠杆菌来源的生物素连接酶BirA的突变体的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸，从而抑制该邻近生物素连接酶的酶活。
[0014]所述邻近生物素连接酶为生物素连接酶TurboID的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸；其中，非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸ONB
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赖氨酸。
[0015]所述邻近生物素连接酶为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第183位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸ONB
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赖氨酸，即SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0016]或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第132位酪氨酸突变为非天然氨基酸ONB
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酪氨酸，即SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。
[0017]或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第172位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸ONB
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赖氨酸，即SEQ ID NO:9所示氨基酸序列、SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。
[0018]一种邻近生物素连接酶的构建方法，对生物素连接酶TurboID的两个邻近ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近，利用正交的和吡咯烷基
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tRNA合成酶进行定点非天然氨基酸插入，获得邻近生物素连接酶。
[0019]所述生物素连接酶TurboID氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸ONB
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赖氨酸或ONB
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酪氨酸。
[0020]一种邻近生物素连接酶的应用，所述邻近生物素连接酶在质谱鉴定中的应用。
[0021]所述邻近生物素连接酶在特定波长紫外光照条件下，对邻近蛋白进行生物素标记在质谱鉴定中的应用。
[0022]一种利用邻近生物素连接酶进行生物素化标记进行质谱鉴定的方法，利用所述邻近生物素连接酶，与目的蛋白融合表达后，定位到特定细胞器，而后在365纳米照射，使邻近生物素连接酶恢复酶活性，进而对目的蛋白的邻近蛋白进行生物素标记，被生物素标记的蛋白通过Streptavidin耦联磁珠富集，进行质谱鉴定。
[0023]本专利技术所具有的优点：
[0024]已有的用于邻近标记的生物素连接酶会随着表达积累，利用培养基中的生物素对邻近蛋白产生较高的生物素化背景，本专利技术设计的光控邻近生物素连接酶，通过将已有邻近生物素连接酶的活性中心附近的氨基酸突变为非天然氨基酸，能够完全使邻近生物素连接酶失活，进而消除积累表达过程中产生的背景，大幅提高质谱鉴定的准确性和特异性。
附图说明
[0025]图1为传统邻近生物素连接酶(A)与本专利技术中光控邻近生物素连接酶(B)的对比示意图。
[0026]图2为不同处理条件下获得总蛋白样品，利用Streptavidin
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HRP检测总蛋白的生物素化的免疫印迹结果图。
[0027]图3为利用本专利技术获得光控生物素连接酶P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种邻近生物素连接酶，其特征在于：邻近生物素连接酶为生物素连接酶中位于ATP或者生物素结合口袋的催化中心位点附近定点插入非天然氨基酸。2.按权利要求1所述的邻近生物素连接酶，其特征在于：所述邻近生物素连接酶为大肠杆菌来源的生物素连接酶BirA的突变体的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸，从而抑制该邻近生物素连接酶的酶活。3.按权利要求2所述的邻近生物素连接酶，其特征在于：所述邻近生物素连接酶为生物素连接酶TurboID的氨基酸序列中第183位赖氨酸、132位酪氨酸、第172位赖氨酸中的一个或几个位点突变为非天然氨基酸；其中，非天然氨基酸为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或ONB
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赖氨酸或ONB
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酪氨酸。4.按权利要求3所述的邻近生物素连接酶，其特征在于：所述邻近生物素连接酶为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第183位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸ONB
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赖氨酸，即SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第132位酪氨酸突变为非天然氨基酸ONB
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酪氨酸，即SEQ ID NO:7所示氨基酸序列；或，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第172位赖氨酸突变为非天然氨基酸MNPY
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赖氨酸或非天然氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李栋，王新禹，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：