一种预防和治疗龋齿的生物酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种预防和治疗龋齿的生物酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述生物酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了所述生物酶在降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜及在抑制致龋菌生物被膜形成和在制备口腔护理产品中的应用。实验证实本发明专利技术所述生物酶对致龋菌变形链球菌所形成的牙菌斑有明显的水解能力，同时其与溶菌酶形成的复合物能明显促进牙菌斑生物被膜瓦解，减少生物被膜中残留活菌量，利用其制成的口香糖或咀嚼片等口腔护理产品能避免抗菌剂的使用，在龋齿预防和治疗中具有巨大应用潜力和市场前景。有巨大应用潜力和市场前景。有巨大应用潜力和市场前景。

【技术实现步骤摘要】
8.0、100mM氯化钠、250mM咪唑；所述阴离子交换层析选Source 15Q HR 16/10,GE Healthcare，其所用洗脱缓冲液是25mM Tris pH 8.0，梯度浓度为0
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1M氯化钠；所述分子排阻层析选Superdex200 10/300GL,GE Healthcare，其所用缓冲液为100mM氯化钠,10mM Tris pH 8.0。
[0010]本专利技术所述预防和治疗龋齿的生物酶在降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜中的应用。
[0011]本专利技术所述预防和治疗龋齿的生物酶在抑制致龋菌生物被膜形成中的应用。
[0012]本专利技术所述预防和治疗龋齿的生物酶在制备口腔护理产品中的应用。
[0013]其中：所述口腔护理产品优选是口香糖或咀嚼片。
[0014]其中，所述口香糖每千克组分的配方是：生物酶与溶菌酶按质量比为(1～50):(1～500)制成的复合物1～20g、胶基300～600g、甜味剂100～200g、香味剂10～50g、甘油20g，余量为药学上所接受的载体；其中所述甜味剂为：麦芽糖、葡萄糖、木糖醇、糖精中的一种或其几种按任意质量比的复配；香味剂为：薄荷香料、柠檬香料、玫瑰香精中的一种或其几种按任意质量比的复配。优选的实施方式是：所述口香糖每千克组分的配方为生物酶与溶菌酶按质量比为(1～20):(30～100)制成的复合物5～15g、胶基100～400g、甜味剂120～170g、香味剂12～40g、甘油20g，余量为药学上所接受的载体。
[0015]其中，所述咀嚼片每千克组分的配方是：生物酶与溶菌酶按质量比为(1～50):(1～500)制成的复合物5～50g、甘油20g、明胶粉100～500g、甜味剂100～200g、香味剂10～50g、润滑剂50g、羧甲基纤维素50g、食用色素5g，余量为药学上所接受的载体；其中，甜味剂为：麦芽糖、葡萄糖、木糖醇、糖精中的一种或其几种按任意质量比的复配；香味剂为：薄荷香料、柠檬香料、玫瑰香精中的一种或其几种按任意质量比的复配；润滑剂为微粉硅胶。优选的实施方式是：所述咀嚼片每千克组分的配方为生物酶与溶菌酶按质量比为(1～20):(30～100)制成的复合物15～40g、甘油20g、明胶粉150～400g、甜味剂120～170g、香味剂12～40g、润滑剂50g、羧甲基纤维素50g、食用色素5g，余量为药学上所接受的载体。
[0016]上述口香糖或咀嚼片的配方中，所述生物酶与溶菌酶制成的复合物中优选生物酶与溶菌酶质量比为1:50；所述甜味剂优选为：麦芽糖、葡萄糖或木糖醇；所述香味剂优选为：薄荷香料、柠檬香料或玫瑰香精。
[0017]本专利技术还公开了一种预防和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有权利要求1所述生物酶和溶菌酶，或者还含有药学上可接受的载体；其中生物酶与溶菌酶二者质量比为(1～50):(1～500)，进一步优选1:50。
[0018]本专利技术提供了一种预防和治疗龋齿的生物酶，并利用该生物酶作为预防和治疗龋齿的有效成分，抑制口腔细菌生物被膜的生成。将生物酶与溶菌酶协同作用，更能进一步有效减少致龋菌牙菌斑的生成，且能减少口腔细菌滋生，减少口腔护理产品中抗菌剂的使用浓度。实验证实本专利技术的生物酶与现有产品相比，安全性高且不易产生副作用，并且对降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜，抑制致龋菌生物被膜形成有明显效果。同时本专利技术所述生物酶与溶菌酶的复合物在预防和治疗龋齿及由此引发的其他口腔疾病中效果更加显著，具有极大应用前景。
附图说明
[0019]图1为通过Ni
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NTA、阴离子交换层析、分子排阻层析进行蛋白纯化的结果。
[0020]其中：图1A为Ni
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NTA及阴离子交换层析Source 15Q纯化结果及SDS
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PAGE结果；图1B为分子排阻层析Superdex 200纯化结果及SDS
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PAGE结果。
[0021]图2为生物酶有效抑制变形链球菌生物被膜形成效果图。
[0022]其中：图2A为结晶紫染色法测定生物酶不同浓度下对生物被膜的抑制效果，外加生物酶浓度为1nM时，可以抑制约50％生物被膜的形成，外加生物酶浓度为50nM时几乎完全抑制生物被膜形成；图2B为激光共聚焦显微镜观察结果，外加生物酶浓度为50nM时几乎没有胞外多糖合成。
[0023]图3为不同浓度生物酶降解变形链球菌已经形成的生物被膜效果图。
[0024]结果显示，生物酶对生物被膜有明显的水解作用，酶浓度为500nM时，水解率达77％。
[0025]图4为生物酶与溶菌酶形成复合物有效减少致龋菌生物被膜中残余活菌量。
[0026]其中：图4A为活菌计数结果，图4B为激光共聚焦观察结果。复合物瓦解生物被膜同时，减少生物被膜中残留活菌量。
[0027]图5为口香糖和咀嚼片配方溶液对釉质片牙菌斑水解效果图。
[0028]结果显示，预防和治疗龋齿的口香糖和咀嚼片对牙菌斑有明显的水解效果。
具体实施方式
[0029]下面结合具体附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明。如下所述例子仅是本专利技术的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本专利技术，并非对本专利技术作任何形式上的限制，凡是依据本专利技术的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本专利技术技术方案的范围内。
[0030]下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。
[0031]下述实施例中：
[0032]所述表达载体pET
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15b购自淼灵生物科技有限公司
[0033]所述大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司。
[0034]所述溶菌酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0035]下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]实施例1：一种预防和治疗龋齿的生物酶的制备
[0037]通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到编码所述预防和治疗龋齿的生物酶的基因核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，并将其连接入pET
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15b表达载体上，得到质粒。将质粒转化进入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到表达菌种。将表达菌株接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中(每1000mL含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,氯化钠10g,氨苄青霉素100mg)，并将细胞置于37℃、200rpm培养直至OD
600
约为0.8，降温至16℃，1小时后向培养基中添加终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导表达，200rpm培养过夜。
[0038]第二天收集菌体(4℃5000
×
g，离心18分钟，弃去上清)，每升菌加入30mL裂解缓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预防和治疗龋齿的生物酶，其特征在于，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述生物酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述预防和治疗龋齿的生物酶的制备方法，其特征在于：将编码所述生物酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.2连接表达载体pET
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15b，引入组氨酸标签，然后转化E.coli BL21(DE3)并进行IPTG诱导表达，筛选出的菌体破碎后离心，上清液加到Ni
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NTA亲和层析柱上，Ni与蛋白中引入的组氨酸标签结合，将目的蛋白挂在层析柱上，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白竞争洗脱下来，所得目的蛋白溶液通过阴离子交换层析和分子排阻层析进一步进行纯化得到所述预防和治疗龋齿的生物酶；其中，所述洗脱缓冲液的配方是：25mM Tris pH 8.0、100mM氯化钠、250mM咪唑；所述阴离子交换层析选Source 15Q HR 16/10,GE Healthcare，其所用洗脱缓冲液含为25mM Tris pH 8.0，浓度梯度为0
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1M氯化钠；所述分子排阻层析选Superdex 200 10/300GL,GE Healthcare，其所用缓冲液为100mM氯化钠,10mM Tris pH 8.0。3.权利要求1所述预防和治疗龋齿的生物酶在降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜中的应用。4.权利要求1所述预防和治疗龋齿的生物酶在抑制致龋菌生物被膜形成中的应用。5.权利要求1所述预防和治疗龋齿的生物酶在制备口腔护理产品...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷立川，刘楠，许素娟，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：