一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法,本发明专利技术从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短之后，获得目的基因序列与pET22b质粒连接，构建出重组表达质粒。截短后基因序列如SEQ ID NO:1所示。设计突变引物，利用重组质粒进行定点突变，并将该突变重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于水稻隐色素表达的基因工程菌；本发明专利技术与现有技术相比，表达的突变体酶D393N的聚合形式发生改变，具有更高的表达量，为体外研究提供了便利；其光还原产生的自由基更多，氧化更缓慢，因此D393N突变体酶有利于其调控水稻的开花周期，使水稻可以趋避利害，进而提高水稻产量。进而提高水稻产量。进而提高水稻产量。

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法

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[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及基因、蛋白质工程
，具体涉及一种水稻隐色素基因及其构建方法。

技术介绍
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[0002]隐色素和光修复酶两种蛋白构成了隐色素/光修复酶蛋白家族(cryptochrome/photolyase family,CPF)，隐色素是由光修复酶进化而来，该家族蛋白具有较高的序列同源性，且具有相似的空间结构，但是二者功能有很大差别。早期的地球氧气稀薄，大气中没有形成臭氧层，导致紫外线可以无阻隔的到达地球，中、短波紫外线会造成生物体的DNA损伤，对生物有很强的杀伤作用。光修复酶能够修复中短波紫外线造成的DNA损伤，主要是吸收蓝光和长波紫外线的光能来进行光活化。而隐色素缺乏光修复能力，是调节植物和动物昼夜节律的光感受器，并作为受体控制植物对蓝光或长波紫外线光的光形态发生。
[0003]光修复酶和隐色素都借助黄素类辅酶吸收光能来发挥作用。所有的隐色素和光修复酶都能结合黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)。FAD具有多种氧化还原形式，分为以下几种：完全氧化型(oxidized,FAD
ox
)，自由基型(semiquinone)和还原型(hydroquinone)。在光修复酶中FAD辅酶的活性形式为还原型，隐色素中FAD辅酶的活性形式为自由基型。
[0004]水稻做为中国主要种植品种，水稻的种植面积为3千万公顷，总产量高达2亿吨以上。水稻隐色素能够蓝光抑制下胚轴伸长、蓝光刺激子叶展开、调控开花时间及气孔开放、引导昼夜节律和调节基因表达，因此可以利于水稻隐色素调控开花周期，使水稻的生长趋利避害，提高水稻产量，这将对国内民生产生重大的影响。而目前对水稻隐色素的研究较为稀缺。

技术实现思路
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[0005]本专利技术所要解决的第1个技术问题是提供一种定点突变的水稻隐色素基因。
[0006]本专利技术所要解决的第2个技术问题是提供含有该基因的表达载体。
[0007]本专利技术所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。
[0008]本专利技术所要解决的第4个技术问题是所述水稻隐色素的制备方法。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0010]一种定点突变的水稻隐色素，该隐色素所编码的基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0011]一种定点突变的水稻隐色素基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
[0012]一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的定点突变的水稻隐色素基因的重组质粒。
[0013]一种宿主，所述的宿主为定点突变的水稻隐色素重组工程菌，该工程菌为大肠杆
菌且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。
[0014]本专利技术采用定点突变的方法改造蛋白：通过聚合酶链式反应(PCR)在目的DNA片段(质粒，基因组)中引入所需变化(包括碱基的添加，删除，点突变)。
[0015]本专利技术从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短，获得目的基因序列与pET22b质粒连接，构建出重组表达质粒；设计突变引物，利用重组质粒进行定点突变，并将该突变重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于水稻隐色素蛋白表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET22b
‑
D393N；在20℃，180rpm/min和1mM IPTG(异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷)条件下获得了较好的表达。
[0016]本专利技术与现有技术相比,本专利技术表达的突变体酶D393N为四聚体，而野生型为单体，聚合形式发生改变。野生型水稻隐色素的蛋白最高吸收峰为254mAU，而D393N突变体的蛋白最高吸收峰为1330mAu，D393N突变体的表达量为野生型的5.23倍，为体外研究提供了便利。此外，D393N突变体光还原产生的自由基更多，氧化更缓慢，表明D393N突变体能使辅酶维持在自由基型。因此D393N突变体酶有利于其调控水稻的开花周期，使水稻的生长趋利避害，进而提高水稻产量。
附图说明:
[0017]图1为WT(wild type)和D393N突变体酶纯化的SDS
‑
PAGE电泳图。
[0018]M为低分子量标准蛋白，泳道1，2分别为实施例3所制的野生型和实施例2所制的D393N突变体酶纯化蛋白分管收集样品。
[0019]图2为实施例3所制的WT水稻隐色素凝胶过滤层析图。
[0020]图3为实施例2所制的D393N突变体酶凝胶过滤层析图。
[0021]图4为实施例2所制的D393N突变体酶还原光谱图
[0022]41、42、43、44、45、46分别为第0s、10s、1min、10min、40min、60min氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。
[0023]图5为实施例3所制的WT水稻隐色素还原光谱图
[0024]51、52、53、54分别为第0s、10s、10min、30min的氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。
[0025]图6为实施例2所制的D393N突变体酶氧化光谱图
[0026]61、62、63、64、65、66、67分别为0min、2min、10min、20min、30min、60min、90min氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。
[0027]图7为实施例3所制的WT水稻隐色素氧化光谱图
[0028]71、72、73、74、75、76分别为0min、1min、5min、10min、20min、30min氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。
具体实施方式:
[0029]下面结合实施例对本专利技术作详细的说明。
[0030]实施例1：突变体酶D393N基因的获得以及表达载体的构建
[0031]1.1获得WT水稻隐色素基因oscry2
[0032]查找NCBI(National Center forBiotechnology,AB103094)水稻的隐色素基因序
列，基于大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中密码子偏好性进行优化并截短，设计适于大肠杆菌表达的基因，交由南京金斯瑞公司人工合成该基因，并装载到pET22b质粒载体上，经由公司测序成功后，寄回构建成功的重组质粒pET22b
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OsCRY2。(郑彬琼.大肠杆菌同义密码子偏好性概述[J].硅谷,2009(01):23
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24.)(Fumiaki Hirose.Involvement of rice cryptochromes in de
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定点突变的水稻隐色素，其特征在于：该隐色素所编码的基因是由SEQ ID NO:1，所示的核苷酸序列组成。2.一种定点突变的水稻隐色素，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的核苷酸序列。4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2所述的氨基酸序列。5.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3所述的载体。6.权利要求1所述的一种定点突变的水稻隐色素的构建方法，包括以下步骤：从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短，获得目...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国萍，刘莉，王鹏，文斌，徐蕾，胡德港，王孟黎，陈雪霏，卞命杰，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：