一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes合成基因fosA、二倍半萜骨架化合物合成酶及其应用，属于基因工程领域。该二倍半萜骨架化合物合成基因来源于尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum FO14005)，其基因、cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，其编码的FoFS蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，该蛋白能催化DMAPP与IPP反应生成fusaoxyspenes。本发明专利技术发现的fosA基因催化产生新的五环二倍半萜骨架化合物，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

【技术实现步骤摘要】
一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种从尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum 14005)中克隆得到的五环二倍半萜骨架化合物Fusaoxyspenes合成基因fosA及其应用。

技术介绍

[0002]萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，是小分子天然产物中最大的一类化合物，到目前为止已发现超过8万种。其中最引起我们关注的是二倍半萜，该类化合物数量较少，占萜类总数不足2％，绝大多数来源于海绵，在植物、真菌、地衣及昆虫分泌物中也有报道。二倍半萜类化合物大多具有广泛的生理活性，如消炎、抗菌、抗结核、抗癌和细胞毒活性等，在药物开发中具有良好前景。其生物合成过程与其他萜类化合物相一致：以二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)为起始单元，在异戊烯基转移酶(Prenyltransferase，PT)作用下与异戊烯基二磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)首尾连接形成不同碳骨架数目的线性多聚异戊烯焦磷酸前体如香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphat，FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP)和香叶基法尼基焦磷酸(Geranylfranesyl pyrophosphat，GFPP)等，然后萜类环化酶(Terpene cyclase，TC)对这些焦磷酸前体进行环化或重排形成萜类骨架环化产物，然后进一步被各种后修饰酶催化反应生成各种萜类化合物。
[0003]从1965年至今发现约80种丝状真菌来源的二倍半萜化合物，这些化合物大多具有广泛的生理活性，在药物开发中具有良好前景。如：分离自Arthrinium sp.FA1744(ATCC 74132)的双环二倍半萜terpestacin，具有显著的抑制血管聚合的活性，ID50为0.46μg/mL，明显优于阳性对照药硫酸葡聚糖(ID
50
为12μg/mL)，研究表明terpestacin的作用靶点是位于线粒体复合物III上的UQCRB，通过抑制低氧引起的活性氧产量和细胞氧传感而发挥作用。Brady等以体外抗MRSA和VREF为导向，从一株内生真菌中分离鉴定一个新骨架二萜化合物guanacastepene。该化合物对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的大肠杆菌有显著的抗菌活性，有望开发成新型抗生素。真菌二萜中最著名的PAF拮抗剂是来自一株海洋真菌(Phoma sp.)的phomactin类成分(phomactinsA～J)，研究证明phomactin D活性最好，抑制PAF受体结合的IC
50
为0.12μM，抑制血小板激活的IC
50
为0.80μΜ
11
。Chinworrungsee在对采自我国台湾的海洋真菌Halorosellinia oceanica的研究中发现其二倍半萜代谢产物halorosellinic acid有一定抗疟活性。Han J.J.等以体外抗炎活性为导向，从Cyathus africanus的固体发酵粗提物中获得一系列新颖结构的鸟巢烷型二萜，其中化合物cyathin F和cyathin H具有优于阳性对照药氢化可的松的抗炎活性，IC
50
分别为2.57和1.45μM。研究者从真菌Cyathus striatus中分离得到一类新的鸟巢烷木糖苷化合物striatoidA
‑
F，在终浓度为10
‑
40μM时，这些化合物具有一定的神经突起生长作用。
[0004]然而，由于资源及技术限制，萜类化合物产量低、获取成本高昂的缺点，人们直接
从自然界中获取新颖骨架的萜类化合物来服务生产生活越来越困难。同时，传统的化学合成的方式获取新的萜类化合物存在反应步骤多、催化选择性差、条件不够温和以及污染环境等缺点，更关键的是其获得全新结构骨架的能力有限。近些年来，随着基因组测序技术及生物信息学的快速发展，人们发现微生物也具备可观的萜类化合物生产潜力。因此，通过针对单个微生物的全基因组分析，采用生物化学、分子生物学与天然产物化学相结合的策略，寻找具有全新催化机制的双功能萜类合酶；并通过构建可高效重构真菌来源萜类物质生物合成途径的异源表达系统，可获得大量新骨架二倍半萜/二萜化合物。为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为解决上述不足进行的，提供了一种二倍半萜化合物的合成酶及合成基因，并基于该合成酶或合成基因提供了一种二倍半萜化合物的生物合成方法。
[0006]本专利技术的思路如下：在挖掘尖孢镰刀菌14005代谢产物二倍半萜类化合物的生物合成过程中，通过对基因基因功能分析，得知fosA基因与萜类合成相关，说明fosA基因参与了二倍半萜类化合物的生物合成。进一步通过异源表达fosA基因获取FoFS蛋白进行体外酶促反应，验证了fosA基因是一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes的合成基因。
[0007]本专利技术的首要目的在于提供一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因及其编码的二倍半萜化合物合成酶；第二目的在于提供所述基因或酶的应用，即在二倍半萜类化合物生物合成中的应用；第三目的在于提供根据上述方法制备得到的五环二倍半萜类化合物。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一方面，提供了一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因(fosA基因)，为从尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum 14005)基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 14005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21067。
[0010]优选的，fosA基因含有3个内含子，其cDNA大小为2181bp，序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术的第二方面，提供了一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成酶，即为fosA基因编码的蛋白，命名为FoFS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，FoFS蛋白能催化DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)、与IPP反应合成fusaoxyspenes。
[0012]所述合成酶含有两个保守结构域：萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg
2+
和底物的特征性保守基序DYVNE和NDYFSYERE；E
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IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIQD和DDYMN。
[0013]本专利技术所述的FoFS蛋白可通过大肠杆菌原核表达系统对fosA基因进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种二倍半萜骨架化合物合成酶，其特征在于，该合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。2.根据权利要求2所述的二倍半萜骨架化合物合成酶，其特征在于，所述合成酶含有两个保守结构域：萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg
2+
和底物的特征性保守基序DYVNE和NDYFSYERE；E
‑
IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIQD和DDYMN。3.编码权利要求1所述的二倍半萜骨架化合物合成酶的基因，其特征在于：为从尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum 14005)基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 14005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21067。4.根据权利要求3所述的编码二倍半萜骨架化合物合成酶的基因，其特征在于，所述基因含有3个内含子，其cDNA大小为2181bp，序列如SEQ ID NO.2所示。5.一种二倍半萜化合物合成酶重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为运载有权利要求1或2所述的二倍半萜化合物合成酶，或运载有权利要求3或4所述基因的真核或原核表达载体。6.一种二倍半萜化合物合成酶重组表达宿主细胞，其特征在于：含有权利要求5所述的重组表达载体。7.采用权利要求3所述的基因异源表达二倍半萜类骨架化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、FosA基因异源表达载体的构建通过PCR技术，以尖孢镰刀菌14005基因组为模板扩增得到含有fosA的基因序列，扩增所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；将扩增得到的片段通过同源重组与pUARA2载体连接，构建pUARA2
‑
fosA表达质粒，并将该连接产物转化到大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋岚，刘雪婷，张立新，张雪，朱国良，王芷馨，张敬宇，兰珂盈，张维燕，吕康杰，邢翠平，杨欢婷，黎晓莹，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：