一种检测抗粘着斑蛋白-IgG抗体的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测抗粘着斑蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种检测抗粘着斑蛋白
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IgG抗体的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学
，涉及一种检测抗粘着斑蛋白
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IgG抗体的试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来儿童肾脏疾病种类越来越多，其中以自身免疫性肾病综合症发病率最高，严重危害了儿童身心健康。自身免疫性肾病综合征即一类因为肾小球滤过膜通透性增加，使得血浆蛋白滤出增多，引起大量蛋白尿，并由此引发病人主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度水肿等特征的临床综合症。Ali等学者观察到，移植了来自难治性微小病变性肾病综合征病人的肾脏后，受者肾脏功能正常未出现任何蛋白尿，由此可见微小病变性肾病综合征病因并非都在肾脏自身，而可能主要是病人的内环境出现了问题。此外，除了部分由基因缺陷而引起的患儿，大部分自身免疫性肾病综合征患儿在经过激素和免疫抑制剂治疗后病情都能好转，这间接证明了该疾病与患者的自身免疫有着密切的联系。
[0003]近年来发现B细胞功能异常在自身免疫性肾病综合征中也具有重要的作用。近些年，全球多个多中心的临床研究成果表明，利妥昔单抗(Rituximab，RTX)能成功用于微小病变性肾病综合征的治疗，特别是在难治性肾病综合征的治疗方面取得了很好的治疗效果。然而研究也发现使用利妥昔单抗治疗激素依赖型肾病综合征的过程中发现，其清除B细胞的作用大约能维持5个月左右的时间，在6到7个月随着B细胞数量的回升患者的病情也会复发。由此提示自身免疫性肾病综合征患者体内存在病理性的B细胞克隆，对这些病理性的B细胞克隆进行鉴别和精准的清除，不仅有利于自身免疫性肾病综合征病情恢复，也减少因为采用利妥昔单抗等手段进行无差别的B细胞清除而给病人带来体液免疫缺陷的风险。然而，迄今为止，自身免疫性肾病综合征患儿体内病理性B细胞针对的靶抗原仍然不是很清楚。从病理特征上来说，微小病变型肾病或局灶节段性肾小球硬化被认为是由于足细胞功能丧失或改变，导致大量蛋白尿的足细胞病。足细胞为肾脏肾小球上皮细胞，附着在肾小球的基底膜的外侧，是阻止蛋白质丢失的最后屏障，足细胞损伤通常会引起大量的蛋白尿。
[0004]Vinculin(粘着斑蛋白)是一种与肌动蛋白结合并参与细胞粘附的细胞质蛋白质。关于Vinculin蛋白研究也有很多，例如一项研究发现，抗Vinculin自身抗体滴度与胃癌患者胃肌丛中Cajal(ICC)间质细胞密度成反比(Kim JH,Nam SJ,Park SC,et al.Association between interstitial cells of Cajal and anti
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vinculin antibody in human stomach.Korean J Physiol Pharmacol24:185
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191.)。Vinculin蛋白在自身免疫性疾病中也有研究，如Brittany L.Adler等发现，与健康对照人群相比，系统性硬化症患者抗Vinculin自身抗体水平更高，Vinculin自身抗体也可能在硬皮病胃肠道功能障碍的发病机制中起重要作用(Brittany L，Adler1，Zsuzsanna McMahan.Anti
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vinculin autoantibodies in systemic sclerosis：a step toward a novel biomarker？ClinicalRheumatology(2021)40：809
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811)。另外Vinculin抗体在肠易激综合征疾病中也有研究，如罗朝领等人涉及一种Vinculin抗体检测试剂盒(罗朝领，陈潇，董敏.一种肠易激综合征标志物Vinculin抗体检测试剂盒及其制备方法.申请号：201610325264.3)。
[0005]但目前关于Vinculin的表达情况和Vinculin的自身抗体的存在情况在肾病综合征中未见报道。另外现有技术中，没有涉及基于靶点Vinculin或其自身抗体作为一种血清学标志物在自身免疫性肾病综合征中的应用。通过检测血清抗Vinculin
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IgG抗体鉴别出自身免疫性肾病综合征的研究是空白的。与罗朝领等人涉及一种肠易激综合征标志物Vinculin抗体检测试剂盒相比，本专利技术试剂盒既可以定性也可以定量检测自身免疫性肾病综合征患者血清中抗Vinculin
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IgG抗体，且本专利技术试剂盒利用人抗标签肽的IgG抗体作为标准品以及结合生物素
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亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种检测抗粘着斑蛋白
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IgG抗体的试剂盒，是一种基于靶点Vinculin及其相应自身抗体的检测试剂盒。所述试剂盒可通过与抗原蛋白Vinculin(特别根据序列识别号SEQ ID NO.1所示)的免疫反应对来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的自身抗体进行检测。
[0007]所述试剂盒由抗原蛋白Vinculin、固相载体、标记抗体如酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的二抗、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色剂、洗涤液、标准品、阳性质控品、阴性质控品组成。
[0008]所述抗原蛋白Vinculin的序列如SEQ ID NO.1所示：PKFREAVKAASDELSKTISPMVMDAKAVAGNISDPGLQKSFLDSGYRILGAVAKVREAFQPQEPDFPPPP QLRLTDELAPPKPPLPEGEVPPPRPPPPEEKDEEFPEQKAGEVINQPMMMAARQLHDEARKWSSKGNDIIAAAKRM ALLMAEMSRLVRGGSGTKRALIQCAKDIAKASDEVTRLAK EVAKQCTDKR LLQVCE RIPTISTQLKILSTVKATMLGRTNISDEESEQATEMLVHN AQNLMQSVKETVREAEAASIKIRTDAGFTLRWVRKTPWYQ。
[0009]本专利技术的Vinculin抗原蛋白可以是融合蛋白，使用具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N
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末端或C
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末端。这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀。在一个优选的实施方案中，所述标签是能够特异性结合配体的序列或结构域，所述的标签肽选自：His标签，硫氧还蛋白，GST标签，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽转移酶的SA标签，c
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Myc标签，Flag标签或生物素标签。
[0010]根据本专利技术，所述抗原蛋白Vinculin固定于固相载体上，优选的固相载体包括：硝酸纤维素膜、磁微粒、酶标微孔板。
[0011]本专利技术一个实施方案中，所述标准品和阳性质控品，标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗Vinculin
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IgG抗体作为阳性质控品和标准品，健康体检者血清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测抗粘着斑蛋白
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IgG抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由抗原蛋白Vinculin、固相载体、标记抗体、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色剂、洗涤液、标准品、阳性质控品、阴性质控品组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Vinculin抗原蛋白的序列如SEQ ID:1所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体为酶标记、化学发光剂标记或生物素标记的二抗。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原蛋白Vinculin上带有标签肽，所述的标签肽包括：His标签，硫氧还蛋白，GST标签，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽转移酶的SA标签，c
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Myc标签，Flag标签或生物素标签。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Vinculin抗原蛋白经镍柱亲和层析、分子筛层析、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、疏水柱纯化。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段，或从血清中提取抗Vinculin
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【专利技术属性】
技术研发人员：叶青，毛建华，田丹丹，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：