【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞制剂，尤其涉及人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂的制备方法及应用。
技术介绍
1、血友病乙是x联锁隐性遗传性单基因病，为f9基因突变造成血浆中凝血因子ix(factor ix，f ix)缺乏或功能障碍，导致凝血功能异常所致。占全部血友病的15％-20％，发病率大约为1/25000。目前预防性使用重组f ix(1-2周/次)的终身替代治疗为治疗血友病乙的主要方法，治疗繁琐且价格昂贵。使用重组f ix治疗后，机体产生抑制物的可能性虽然较小，约占病人总数的1-5％，但在有抗fix抑制物的患者中再次使用重组f ix经常会发生过敏反应，因此限制了重组f ix的应用。
2、使用aav系列的基因治疗有彻底治愈血友病乙的可能。重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated vector，raav)的构建通常是将rep和cap基因的剔除和将感兴趣的基因插入itrs序列之间。产生的载体质粒随后与包装质粒(能表达aav rep和cap基因的质粒)一起共转染到组织细胞中。因此，raav载体在宿主细胞内只能提供可持久表达的治疗蛋白。这与慢病毒和逆转录病毒载体相比，具有明显的安全性。编码衣壳序列的轻微差别能明显影响载体对组织的趋向性及提高基因转染的效率。目前许多自然发生的和基因工程的aav衣壳已经被鉴定。而raav载体对肝脏具有高度的趋向性，而且raav载体通过靶向性基因转移来转染有丝分裂后期细胞。这对种系传递的危险性下降，也减少了炎症反应。不利因素是只能容纳较小的治疗性基因。总的来说，相对
3、2022年11月，美国食品和药物管理局(fda)批准了首个用于治疗成年血友病b患者的基因疗法，使用aav5作为载体递送fix变体padua 1。然而，aav的有效转导由于需要将其单链(ss)基因组转化为可在靶细胞中转录的双链(ds)形式而受到阻碍。aav-dj是腺病毒相关病毒2型、8型和9型的嵌合体，而aav-dj/8是aav-dj在肝素结合域的突变体。aav-dj/8与其最近的天然亲缘关系(aav-2)有60个衣壳氨基酸的差异。在细胞培养中，重组aav-dj/8载体的表现优于8种标准aav血清型，在肝脏中，重组aav-dj/8载体的表现大大优于aav-2。目前还未应用到血友病乙的基因治疗中。
4、人间充质干细胞(the human umbilical cord mesenchymal stemcells，hucmscs)是具有自我更新并具有多向分化功能的基质细胞。具有低免疫力及免疫调节作用，是细胞治疗的良好载体。
5、目前间充质干细胞应用于癌症、糖尿病、肝纤维化、心肌梗死等模式的研究。但采用hucmscs为载体细胞用于血友病乙的治疗未见报道。
技术实现思路
1、1.要解决的技术问题
2、本专利技术的目的是为了解决现有技术中还未有采用能自动分泌凝血因子ix的hucmscs为载体细胞用于治疗血友病乙的问题，而提出的人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂的制备方法及应用。
3、2.技术方案
4、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
5、人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂，所述干细胞制剂为hucmscs干细胞制剂。
6、本专利技术中还提出了人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂的制备方法，具体步骤为：
7、步骤1：精炼凝血因子ix基因f9装载入scaav-dj/8，并在f9基因前加人脂蛋白肝控制区和人抗胰蛋白酶α1基因启动子，形成能稳定高表达具有fix活性的双链腺相关病毒载体scaav-dj/8-lp1-hfixco载体；
8、步骤2：scaav-dj/8-lp1-hfixco转入hucmscs，按1000:1的比例，将scaav-dj/8-lp1-hfixco与消化下来的hucmsc混合后培养；并在混合后24小时、48小时、72小时后收集上清，得到hucmscs干细胞制剂。
9、优选地，所述步骤1中scaav8载体的提供、scaav-lp1-hfixco的合成委托有关商业公司完成，所述双链腺相关病毒载体scaav-dj/8-lp1-hfixco已于2023年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：v2023112。
10、优选地，所述步骤1中使用aav-dj/8helper free bicistronic expressionsystem kit试剂盒完成scaav-dj/8-lp1-hfixco的组装，扩增。
11、优选地，所使用的可扩增细胞为hek293t细胞株。
12、本专利技术中还提出了人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂应用于治疗人乙型血友病。
13、本专利技术中还提出了人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂应用于fix缺乏的病人体内基因治疗。
14、3.有益效果
15、相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
16、(1)本专利技术中，克服了传统基因治疗使用大剂量aav载体(约1011-1012载体基因组/千克)直接注入体内，导致不同组织尤其肝脏损伤的缺点。克服体内由于存在抗aav抗体而导致基因治疗失败的缺点。基因治疗与细胞治疗相结合，产生以细胞治疗为基础的基因治疗。对基因治疗及细胞治疗都是有益的探索。
17、(2)本专利技术中，首次将scaav-dj/8-lp1-hfixco成功导入hucmscs，并在细胞层面检测到f ix稳定表达，在凝血因子ix基因敲除小鼠的实验研究中能显著改善小鼠的凝血功能。有望进一步应用于血友病乙细胞治疗为基础的基因治疗中。
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1.人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制剂为HUCMSCs干细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
3.根据权利要求2所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中ScAAV8载体的提供、ScAAV-LP1-hFIXco的合成委托有关商业公司完成，所述双链腺相关病毒载体ScAAV-DJ/8-LP1-hFIXco已于2023年12月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V2023112。
4.根据权利要求2所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中使用AAV-DJ/8Helper Free Bicistronic expression system kit试剂盒完成ScAAV-DJ/8-LP1-hFIXco的组装，扩增。
5.根据权利要求4所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所使用的可扩增细胞为HEK293
6.根据权利要求1所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的应用，其特征在于，应用于治疗人乙型血友病。
7.根据权利要求1所述的人精炼凝血因子IX介导间充质干细胞制剂的的应用，其特征在于，应用于病人体内基因治疗。
...【技术特征摘要】
1.人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制剂为hucmscs干细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
3.根据权利要求2所述的人精炼凝血因子ix介导间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中scaav8载体的提供、scaav-lp1-hfixco的合成委托有关商业公司完成，所述双链腺相关病毒载体scaav-dj/8-lp1-hfixco已于2023年12月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：v2023112。
4.根据权利要求2所述的人精炼凝血因...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤永民，卜梓斌，徐晓军，徐卫群，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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