【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及质谱检测领域，尤其涉及一种粪便和肠道内容物的87种胆汁酸的提取及定量检测的方法。
技术介绍
1、胆汁酸是胆汁的主要成分，由胆固醇在肝脏合成(初级胆汁酸)，随胆汁排入肠道，经肠道细菌分解，形成次级胆汁酸后，由小肠重吸收，经门静脉入血回流至肝脏，一部分被肝细胞摄取，而另外少量进入血液循环，形成胆汁酸的“肝肠循环”。整个循环中约有5％的胆汁酸通过粪便排出体外，由于粪便和肠道内容物样本中含有丰富的胆汁酸信息，且粪便样本的无创的采样方式，已成为临床诊断的重要样本。因为微生物中含有的多种已知的胆汁酸代谢酶，这些酶通过去结合、7ɑ-脱羟基、异构化、氧化、脱硫和酯化等生化反应，调节胆汁酸的化学多样性。在处理新鲜或超低温存储粪便和肠道内容物样本时，必须有效抑制或终止这些酶反应，否则会导致胆汁酸定量结果不准确。
2、当肝脏或胆囊发生病变，如肝炎、非酒精性脂肪肝、妊娠期胆汁淤积症等，会破坏胆汁酸的“肝肠循环”稳态，导致血清中总胆汁酸水平显著升高。但是，不同疾病具有不同的胆汁酸特征谱。因此，目前的临床实践将总胆汁酸水平这个单一指标作为肝胆疾病鉴别标志物，存在明显局限性。胆汁酸根据其化学结构的不同，可分为游离型胆汁酸和结合型胆汁酸。游离型胆汁酸可与氨基酸(如甘氨酸、牛磺酸、苯丙氨胆酸、酪氨胆酸及亮氨胆酸)、脂肪酸、磺酸、葡萄糖醛酸等发生结合反应，形成多种亚型。这些胆汁酸亚型种类繁多且结构高度相似，存在很多对同分异构体，因此亟需一种高分离度、高灵敏度和高通量的分析技术来检测胆汁酸亚型。与传统化学发光、免疫学技术相比，液质联用技术兼
3、虽然液质联用方法已经广泛地用于胆汁酸代谢谱检测，但现有的方法仍然存在明显不足。比如说在样本前处理方面，迄今尚未涉及粪便和肠道内容物样本解冻后胆汁酸谱稳定性的相关研究报道。在液质检测方法方面，现有文献报道的胆汁酸亚型覆盖度相对较低，一般检测15-40种左右的胆汁酸亚型，缺少磺酸结合型、葡萄糖醛酸结合型及其他氨基酸结合型等重要类型胆汁酸的数据，或者是只针对某特定形式的胆汁酸亚型如磺酸结合型、葡萄糖醛酸结合型独立检测。而具有较高的覆盖度(大约70种胆汁酸谱)的个别文献的方法，其检测时间超过30min。此外，为了提高胆汁酸亚型的覆盖度，一些研究在样本前处理采用衍生化技术，然而这种技术显著依赖于衍生化试剂的效率和反应温度，极大增加了分析复杂性和成本。综上所述，迄今尚未有方法能够同时兼顾样本前处理稳定性、分析时间、胆汁酸亚型覆盖度及胆汁酸精确定量。
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，本专利技术实现了一种粪便和肠道内容物的87种胆汁酸的提取及定量检测方法。本专利技术方法有效保障粪便和肠道内容物样本中的胆汁酸原始状态，提高了胆汁酸亚型的覆盖度，并且分析时间仅需15分钟。
2、本专利技术的87种胆汁酸包括：
3、游离型胆汁酸(39种)：β-熊果胆酸、脱氢胆酸、7,12-二酮石胆酸、熊果胆酸、7-脱氢胆酸、12-脱氢胆酸、muro-胆酸、β-熊去氧胆酸、3-脱氢胆酸、β-猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、6-酮石胆酸、β-去氧胆酸、7-酮石胆酸、脱氢去氧胆酸、脱氢鹅去氧胆酸、23-去甲去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、别石胆酸、异石胆酸、异去氧胆酸、石胆酸、脱氢石胆酸、β-胆酸、ω-鼠胆酸、α-鼠胆酸、非胆酸、β-鼠胆酸、猪胆酸、别胆酸、胆酸、β-鹅去氧胆酸、7-酮石胆酸、12-酮石胆酸、原胆酸、β-脱氢鹅去氧胆酸、β-脱氢去氧胆酸；
4、甘氨结合型胆汁酸(8种)：甘氨脱氢胆酸、甘氨猪胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨石胆酸；
5、牛磺结合型胆汁酸(11种)：牛磺脱氢胆酸、牛磺ω-鼠胆酸、牛磺α-鼠胆酸、牛磺β-鼠胆酸、牛磺猪胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺石胆酸；
6、硫磺结合型胆汁酸(10种)：猪胆酸-3-磺酸、胆酸-7-磺酸、熊去氧胆酸-3-磺酸、胆酸-3-磺酸、猪去氧胆酸-3-磺酸、鹅去氧胆酸-3-磺酸、鹅去氧胆酸-7-磺酸、去氧胆酸-3-磺酸、异石胆酸-3-磺酸、石胆酸-3-磺酸；
7、硫磺甘氨结合型胆汁酸(7种)：甘氨猪胆酸-3-磺酸、甘氨熊去氧胆酸-3-磺酸、甘氨猪去氧胆酸-3-磺酸、甘氨胆酸-3-磺酸、甘氨鹅去氧胆酸-3-磺酸、甘氨去氧胆酸-3-磺酸、甘氨石胆酸-3-磺酸；
8、硫磺牛磺结合型胆汁酸(5种)：牛磺熊去氧胆酸-3-磺酸、牛磺猪去氧胆酸-3-磺酸、牛磺胆酸-3-磺酸、牛磺鹅去氧胆酸-3-磺酸、牛磺石胆酸-3-磺酸；
9、葡萄糖醛酸结合型胆汁酸(4种)：鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-24-葡糖苷、去氧胆酸-24-葡糖苷、去氧胆酸-3-葡糖苷；
10、其他结合型胆汁酸(3种)：酪氨胆酸、苯丙氨胆酸、亮氨胆酸。
11、粪便和肠道内容物样本中存在数量庞大、种类繁多的微生物群落，这些微生物的细胞中含有各种各样的生物活性酶，可将初级代谢物转化成次级代谢物。本专利技术发现，即使在低温环境下(如：4-8度冷藏)，结合型胆汁酸仍会水解为游离型胆汁酸，导致胆汁酸定性和定量结果不准确。常规方法如采用冰浴控温、调节提取液的ph值等均未能有效解决这一难题，因此粪便和肠道内容物样本中的胆汁酸定性定量结果的准确性是当前检测的难点。本专利技术创新性地在样本前处理方法中引入一种创新助剂aaa-10，该化合物是一种石胆酸类似物，结构式如式(1)所示，cas：2758171-70-7。实验证明，添加aaa-10抑制了结合型胆汁酸的水解反应，最大程度地保证了粪便及肠道内容物生物样本中胆汁酸亚型的原始状态，从而确保了检测结果准确可靠性。
12、
13、粪便和肠道内容物样本中胆汁酸种类极为丰富，其浓度呈现数量级的差异，范围从pmol/l至μmol/l。具体而言，脱氧胆酸、石胆酸等次级胆汁酸浓度可达mg/g级别，在疾病状态下，这些胆汁酸的含量会超过了检测方法的定量上限，甚至超出质谱检测器检测范围而出现信号饱和现象，导致出现实际定量结果偏低。尽管一些学者尝试通过减少前处理样本量或增加后续样本稀释倍数等解决方式，但是这些操作会使得浓度较低的胆汁酸低于检测下限，很难在一针进样中实现对所有胆汁酸的准确定量分析。
14、为了解决上述问题，本专利技术通过巧妙采用质谱碰撞能量控制策略，对高浓度胆汁酸，本方法采用原型通道、验证通道(val)和高能量通道(hice)三种检测方式并列，即平行反应监测(parallel mrm，缩写pmrm)。这一策略实现了一次进样的情况下，实现了对极高和低浓度的胆汁酸全谱数据的准确定量。hice通道保持母离子、子离子和锥孔电压与原型通道一致，通过优化碰撞能量，使得hice通道响应不超过仪器信号本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种粪便和/或肠道内容物的87种胆汁酸的提取方法，其特征在于，包括对粪便和/或肠道内容物样本的前处理，所述前处理包括加入助剂AAA-10，所述助剂AAA-10具有式(1)所示的结构。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述粪便和/或肠内容物样本与助剂AAA-10的固液比范围为1:4～1:24，AAA-10浓度范围为10～200μM。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)所述预冷提取液为乙腈：甲醇，体积比为80:20；或为乙腈：甲醇：异丙醇，体积比为80:10:10；或为乙腈：异丙醇，体积比为80:20。
5.一种粪便和/或肠道内容物的87种胆汁酸的定量检测方法，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述的提取方法，还包括液相色谱串联质谱上机测试；所述液相色谱串联质谱的流动相B相为乙腈：甲醇：异丙醇，体积比为80:10:10，流动相A相含浓度范围为1～10mM的乙酸铵、0.01％～1％的全氟戊酸。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱选择实心核颗粒C18色谱柱，所述色谱柱直径为2.1mm，长度为100mm，填料粒径为1.6μm；柱温保持在30℃。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的流动相梯度为：
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱仪采用平行反应监测pMRM策略。在原型通道的基础上，通过优化碰撞能电压和多重反应监测通道中的特征离子碎片，增设HICE通道和Val通道，以实现对胆汁酸同分异构体的区分以及极高和低浓度的准确定量。
10.一种AAA-10用于制备定量检测粪便和肠道内容物中胆汁酸的前处理助剂的用途，所述助剂AAA-10具有式(1)所示的结构。
...【技术特征摘要】
1.一种粪便和/或肠道内容物的87种胆汁酸的提取方法，其特征在于，包括对粪便和/或肠道内容物样本的前处理，所述前处理包括加入助剂aaa-10，所述助剂aaa-10具有式(1)所示的结构。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述粪便和/或肠内容物样本与助剂aaa-10的固液比范围为1:4～1:24，aaa-10浓度范围为10～200μm。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)所述预冷提取液为乙腈：甲醇，体积比为80:20；或为乙腈：甲醇：异丙醇，体积比为80:10:10；或为乙腈：异丙醇，体积比为80:20。
5.一种粪便和/或肠道内容物的87种胆汁酸的定量检测方法，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述的提取方法，还包括液相色谱串联质谱上机测试；所述液相色谱串联质谱的流动相b相为乙腈：甲醇：异丙醇，体积比为80:10:10，流动相a相...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪艳，刘阿娜，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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