【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种生产l-乳酸的基因工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
1、基于石油等化石资源的持续消耗，全球已着眼于可再生的生物质资源的进一步利用以缓解化石能源消耗的压力。目前，基于农业和林业产业的迅速发展，可降解生物质包括葡萄糖、木糖、淀粉和纤维素等，是发酵工业中普遍可以被微生物利用的碳源和能源化合物。我国生物发酵工业发展十分迅速，通过对可再生生物质资源的利用和开发，一方面减少了对化石能源等的依赖，另一方面也能够降低部分高附加值化学品的生产成本。通过代谢工程改造微生物和发酵过程优化，能够有效将生物质资源向高附加值化学品进行催化转化。
2、聚乳酸(polylactic acid，pla)是一种由乳酸单体缩聚而成的一种可被微生物降解的高分子聚合物，构成该聚合物的单体乳酸常通过微生物发酵的手段获得。由于pla是一种可再生且可降解的生物质来源聚合物，因此被产业界认定为是一种具有极大发展潜力新型的“生物基材料”。由pla制成的各类用品具有一定的耐热性，透光性，耐磨性，耐拉伸性，以及具有光滑的手感，在一定程度上可以替代部分塑料制品。此外，pla产品还具有无毒，无刺激性和良好的生物相容性。因此，以pla为原料制得的产品具有良好的市场应用前景，目前主要应用于林业、农业、建筑、造纸、医疗及服饰等领域。
3、现有技术中l-乳酸主要是由化学合成法和微生物发酵获得，但是化学合成得到的l-乳酸光学纯度低，且生产过程中成本高昂，过程复杂，且会造成环境污染，因此化学合成法难以满足日益增加的l-乳酸的需求。生物发酵法
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有技术中l-乳酸生产过程中所存在的效率低、纯度低等技术问题，从而通过基因工程队酿酒酵母菌进行改造，以提高其l-乳酸的生产效率，同时能够直接利用竹材作为碳源进行l-乳酸的高效生产。
2、为达到上述目的，本专利技术是通过如下手段得以实现的：
3、本专利技术第一方面提供了一种生产l-乳酸的基因工程菌，所述的基因工程菌以酿酒酵母菌为受体菌，其中过表达l-乳酸脱氢酶基因ldh2，敲除单羧酸/h+转运体基因jen1、醇脱氢酶基因adh1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因g pd1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gpd2。
4、作为优选地，所述酿酒酵母菌为cen.pk113-5d。
5、作为优选地，通过将重组表达载体导入到受体菌中以实现l-乳酸脱氢酶基因ldh2的过表达。
6、作为优选地，所述重组表达载体通过吉布森组装的方法构建得到：对启动子ptdh3(序列如seq id no：1所示)、l-乳酸脱氢酶基因ldh2(序列如seq id no：2所示)以及终止子tcyc1(序列如seq id no：3所示)分别采用bsai酶切获得粘性末端，再与空载体pugg1经过bsai酶切后的线性化载体进行连接，得到表达载体pugg1-ldh2；同时ptdh3序列的第46-712位所示dna片段作为启动子，l-乳酸脱氢酶基因的第15-995位所示的dna片段作为来自鼠李糖乳杆菌的ldh2基因，tcyc1序列的第11-204位所示的dna片段作为终止子，构成完整表达的表达载体。
7、作为优选地，通过crispr-cas9对单羧酸/h+转运体基因jen1(序列如seq id no：4所示)、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gpd1(序列如seq id no：5所示)、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gpd2(序列如seq id no：6所示)、醇脱氢酶基因adh1(序列如seq idno：7所示)进行敲除。
8、作为优选地，采用crispr-cas9对单羧酸/h+转运体基因jen1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：8所示。
9、作为优选地，采用crispr-cas9对nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gp d1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：9所示。
10、作为优选地，采用crispr-cas9对nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gp d2进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：10所示。
11、作为优选地，采用crispr-cas9对醇脱氢酶基因adh1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：11所示。
12、本专利技术第二方面提供了一种生产l-乳酸的基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
13、(1)利用基因编辑工具敲除酿酒酵母基因组上的单羧酸/h+转运体基因jen 1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gpd1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gpd2、醇脱氢酶基因adh1；
14、(2)将重组表达载体导入到酿酒酵母菌中以实现l-乳酸脱氢酶基因ldh2的过表达。
15、作为优选地，步骤(1)中所述基因编辑工具选自crispr-cas9。
16、作为优选地，步骤(1)中单羧酸/h+转运体基因jen1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：8所示。
17、作为优选地，步骤(1)中对nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gpd1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：9所示。
18、作为优选地，步骤(1)中对nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gpd2进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：10所示。
19、作为优选地，步骤(1)中对醇脱氢酶基因adh1进行敲除时，同源重组片段的核苷酸序列如seq id no：11所示。
20、本专利技术第三方面提供了上述生产l-乳酸的基因工程菌在生产l-乳酸中的应用。
21、作为优选地，所述生产l-乳酸中的应用是以竹材、竹材水解物中的一种或多种为原料。
22、本专利技术第四方面提供了一种生产l-乳酸的方法，包括如下步骤：
23、(1)向培养基中加入碳源，得到混合培养基；
24、(2)向混合培养基中接种上述生产l-乳酸的基因工程菌，恒温震荡发酵培养。
25、作为优选地，步骤(1)所述培养基选自delft培养基。
26、作为优选地，步骤(1)中所述培养基中任选地还添加有微量元素溶液、维生素溶液中的一种或多种。
27、作为优选地，所述微量元素溶液的浓度为0.5-2ml/l。
28、作为优选地，所述维生素溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产L-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌以酿酒酵母菌为受体菌，其中过表达L-乳酸脱氢酶基因ldh2，敲除单羧酸/H+转运体基因JEN1、醇脱氢酶基因ADH1、NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因GPD1、NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因GPD2。
2.根据权利要求1所述的生产L-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母菌为CEN.PK113-5D。
3.根据权利要求1所述的生产L-乳酸的基因工程菌，其特征在于，通过将重组表达载体导入到受体菌中以实现L-乳酸脱氢酶基因ldh2的过表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生产L-乳酸的基因工程菌，其特征在于，通过CRISPR-Cas9对单羧酸/H+转运体基因JEN1、醇脱氢酶基因ADH1、NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因GPD1、NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因GPD2进行敲除。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生产L-乳酸的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求1-4任一项所述的生产L-乳酸
7.一种生产L-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述碳源选自竹材水解物、葡萄糖中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述混合培养基中碳源的浓度为10-50g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述竹材水解物通过如下方法制备得到：将竹浆板粉碎后加入水，高温灭菌冷却后加入纤维素酶，恒温反应即得。
...【技术特征摘要】
1.一种生产l-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌以酿酒酵母菌为受体菌，其中过表达l-乳酸脱氢酶基因ldh2，敲除单羧酸/h+转运体基因jen1、醇脱氢酶基因adh1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gpd1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶2基因gpd2。
2.根据权利要求1所述的生产l-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母菌为cen.pk113-5d。
3.根据权利要求1所述的生产l-乳酸的基因工程菌，其特征在于，通过将重组表达载体导入到受体菌中以实现l-乳酸脱氢酶基因ldh2的过表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生产l-乳酸的基因工程菌，其特征在于，通过crispr-cas9对单羧酸/h+转运体基因jen1、醇脱氢酶基因adh1、nad+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶1基因gpd1、nad+依赖的...
【专利技术属性】
技术研发人员：笪央央，刘杏娥，江泽慧，杨淑敏，马建锋，田根林，尚莉莉，马千里，刘真真，赵琳，李雨君，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：
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