基于木霉-芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液的生物种衣剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于木霉

【技术实现步骤摘要】
基于木霉
‑
芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液的生物种衣剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种基于木霉菌
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芽孢杆菌共生培养(共发酵)的生物种衣剂制备技术及应用，主要通过共发酵技术制备共生菌液，以硅藻土吸附菌液、以芸苔素内酯为助剂制备干粉剂型生物种衣剂。该生物种衣剂具有较高含量木霉菌及芽孢杆菌活孢子数、抗菌肽、吲哚乙酸等，因此具有较强的诱导作物抗病性和促进作物生长功能等特点。

技术介绍

[0002]化学种衣剂是我国目前粮食作物生产中应用最为普遍的防治土传病害与地下害虫、促进作物长、提高抗逆性的农化制剂。随着我国对农业生产中的农药和化肥“双减”计划的实施，种衣剂需要向绿色化和生态化方向发展。实践证明微生物种衣剂是实现种子益菌化的重要途径。微生物种衣剂一方面可以减少传统农药对土壤的危害，还可改良作物土壤菌群结构，促进作物增长。但至今微生物种衣剂主要有效菌种单一，菌种孢子抗逆性和活性差，菌种代谢物利用不充分，防效和促生作用不稳定等问题，因此开发利用多菌组合种衣剂对提高生物种衣剂质量和功效具有重要意义。
[0003]木霉作为国际上公认的生防菌之一，对土壤土传病害、土壤农业化污染具有良好的防治及修复效果。木霉菌可以产生疏水蛋白、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗性次生代谢物等生物防治病害的相关物质(陈捷木霉菌诱导植物抗病性研究新进展[J],中国生物防治,2014,31(5)733
‑
741)，国际已开发有单一木霉菌类生物种衣剂(Nayaka S.C，etal.Seed biopriming with novel strain of Trichoderma harzianum for the control of toxigenic Fusarium verticillioides and fumonisins in maize Archiv f
ü
r Pflanzenschutz.2010,264
‑
282)，主要用于玉米生产。芽孢杆菌作为国际公认的生防菌之一，主要用于叶部病害生物防治和促生作用，分泌蛋白类、脂肽类及其次级代谢产物等拮抗物质及IAA和IBA等促生物质。单一木霉菌与芽孢杆菌制剂目前在防治作物病害、促进作物生长中较为常见，但使用过程中单一菌株应用的缺点逐渐显露，如木霉菌对土传病害防效明显，但菌剂抗逆性差；芽孢杆菌对叶部病害防效明显，抗逆性强，但诱导作物抗病和抗逆性不如木霉菌，为此国内外很多厂家仅是将木霉菌和芽孢杆菌分别发酵，然后混配制备成复合制剂，但仍不能解决目前国内外产品木霉菌和芽孢杆菌产品趋同性的难题。随着合成生物的学的发展，木霉菌和芽孢杆共发酵技术成为研究热点，真菌和细菌通过共发酵过程中的相互作用，诱导产生了一系列新的初生和次生代物质，为制备新型生物种衣剂提供了物质基础，因此本研究基于木霉菌和芽孢杆菌的共发酵技术的新型生物种衣剂创制技术对于提高我国生物种衣剂创新水平具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种木霉
‑
芽孢杆菌共生型生物种衣剂制备技术及应用方法。本专利技术技术重点是利用已筛选获得的木霉菌
‑
芽孢杆菌亲和组合通过建立的顺序接种
法进行共发酵获得高含量木霉和芽孢杆菌孢子、抗菌肽(丙甲菌素等)和生长调节物质(吲哚乙酸等)的发酵液，并通过硅藻土的吸附制备成两菌共生型生物种衣剂，从而提生物种衣剂对作物生长和病害防治的效果。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]1、木霉
‑
芽孢杆菌共生培养的生物种衣剂制备技术，包括如下步骤：
[0007]S1.制备木霉
‑
芽孢杆菌共生发酵液；
[0008]S2.制备木霉
‑
芽孢杆菌共生发酵液与硅藻土、芸苔素内酯混合；
[0009]S3.检测粉剂型生物种衣剂质量
[0010]2、在步骤S1中，利用共发酵技术，提高木霉菌
‑
芽孢杆菌互作代谢水平，同时保持相当水平的两类菌的孢子数量。
[0011]作为优选方案，步骤S1中，共发酵菌液的制备方法为：
[0012]将木霉菌株接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养5天后，利用5mm打孔器打孔，接种于PD培养基中，在PD培养基培养3天，较菌物转接种于发酵罐共生培养中28℃发酵48h，通气量0.8～1vvm，pH为5.0～5.6，转速为120rpm。
[0013]将芽孢杆菌接种在LBA培养基中，在在30℃条件下培养2天后，利用5mm打孔器打孔，接种于LB培养基中30℃培养2天。将芽孢菌液转接种于上述已发酵2天木霉发酵液(共生培养基)中，共发酵通气量1～1.3vvm，利用氨水调整发酵培养pH为4.5～5.5，转速为140rpm。发酵时按照共发酵时间范围45～50h，当芽孢杆菌孢子形成85％，木霉菌厚垣孢子形成90％，抗菌肽丙甲菌素达到范围0.1～0.5μg/L和吲哚乙酸达到2000～2500μg/L时发酵完成，下罐。
[0014]作为优选方案，步骤S2所述木霉菌
‑
芽孢杆菌共发酵液与硅藻土、芸苔素内酯混合干燥方法为：
[0015]共发酵培养完成后，利用离心机固液分离，将富集的混合孢子按照质量比(孢子：硅藻土:0.1％芸苔素内酯＝25％:60％:15％)均匀混合，在孢子干燥机中(温度45
‑
48℃)，烘干至水分为5％，过80目筛,制得木霉菌
‑
芽孢杆菌
‑
芸苔素内酯干粉生物种衣剂。
[0016]作为优先方案，步骤S3，采用稀释平板法检测共生菌粉,木霉孢子含量为0.8
‑
1.5
×
108cfu/g，芽孢杆菌孢子含量为2.0
‑
5.0
×
109cfu/g,抗菌肽(丙甲菌素)含量0.1039μg/L，吲哚乙酸含量2159.53μg/L。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0018]1、木霉
‑
芽孢杆菌共生发酵液与单独木霉发酵液相比具有较高含量的丙甲菌素、吲哚乙酸含量；需要指出的是，与现有技术所采用的共培养不同的是，本案为共生发酵，由此可以克服共培养导致的微生物间的拮抗或是竞争效应，而导致其中某一个微生物的生长。
[0019]2、木霉
‑
芽孢杆菌共生型干粉种衣剂相较于液体种衣剂，具有更为稳定的孢子含量；
[0020]3、木霉
‑
芽孢杆菌共生型干粉种衣剂具有比单一木霉菌或芽孢杆菌及两者分加发酵简单组合更高防治病害和促进作物生长的功能。
附图说明：
[0021]图1表示种衣剂对小麦出苗率的影响；
[0022]图2表示木霉菌
‑
芽孢杆菌共生型种衣剂对小麦赤霉病防效的影响。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于木霉
‑
芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液，其特征在于，所述木霉接种量为总发酵量的1
‑
2％v/v，先单一接种木霉，并在25℃
‑
28℃培养35
‑
45小时，再接种芽孢杆菌，接种量为总发酵量的2.0
‑
3.0％v/v，28
‑
30℃共培养48小时。2.一种生物种衣剂，其特征在于，所述生物种衣剂包括如权利要求1所述的基于木霉
‑
芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液。3.根据权利要求2所述的生物种衣剂，其特征在，所述木霉
‑
芽孢杆菌共生培养发酵液的标志物丙甲菌素含量为0.04
‑
0.05μg/L，吲哚乙酸含量为900
‑
1000μg/L，木霉孢子含量为1.0
‑
9.0
×
108cfu/L，芽孢杆菌孢子含量为1.0
‑
9.0
×
109cfu/L。4.根据权利要求2所述的生物种衣剂，其特征在于，所述生物种衣剂采用干粉型。5.根据权利要求2所述的生物种衣剂，其特征在于，包括木霉
‑
芽孢杆菌共生培养菌物、硅藻土和芸苔素内酯组分，具体如下：木霉
‑
芽孢杆菌共生培养菌物：20％
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30％w/w硅藻土：40
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60％w/w芸苔素内酯：12％
‑
20％w/w，所述芸苔素内脂为0.1％可溶液。6.一种如权利要求2
‑
5中任意一项所述的生物种衣剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1.制备木霉
‑
芽孢杆菌共生发酵液；步骤S2.制备木霉
‑
芽孢杆菌共...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈捷，刘鹏，王新华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：