用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法，所述用于2019新型冠状病毒检测的引物组包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，环引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明专利技术提供的新型冠状病毒恒温显色扩增内外环引物组，以的恒温显色筛查检测方法，检测方法特异性强，灵敏度高，仅使用廉价、便捷的恒温水浴锅即可获得检测结果，是对新型冠状病毒检测S基因方法和试剂盒的有力补充。补充。

【技术实现步骤摘要】
用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]目前新型冠状病毒核酸检测试剂不仅短缺，而且存在着检出率不高，经常出现假阴性的问题；而且受PCR实验环境设施的严格要求，具有检测资质的实验室数量有限。这些都在影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。
[0003]2019年新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种单链RNA冠状病毒，基因组序列由29903bp构成，该基因组拥有10个基因，可以有效编码10个蛋白。它可引起呼吸道感染，目前WHO已统一命名为“新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，NCP)”。由于疫情发展迅速，及时对不同程度临床症状病人及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，新冠病毒RNA检测可为诊断提供直接证据，在目前最新版本(新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版))的诊疗方案中，新冠病毒核酸的检出仍是唯一确诊依据。从技术的角度看，在灵敏度和特异性的平衡上，相比较一些快速检测方法，目前平衡的最好的仍是实时荧光PCR(RT-PCR)检测技术。从过往的重大疫情来看，无论是西非埃博拉病毒、甲流还是中东呼吸综合征，RT-PCR仍是国家首推的检测手段。
[0004]基于病毒基因保守序列的RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的常用方法，本次疫情的新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S蛋白基因区位点；可以只检测RdRP基因或者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定量。
[0005]WHO推荐的6套检测靶点病毒保守序列有ORF1a基因、ORF1ab基因(特异性靶点RdRP)、S基因、E基因、M基因、N基因。目前，中国检测ORF1ab和N基因；德国检测RdRP、E基因、N基因；中国香港检测ORF1b-nsp14、N基因；日本检测筛查冠状病毒多基因、S基因；泰国检测N基因；美国检测N基因、PdRP。目前仅以ORF1ab和N基因作为检测靶标存在着一定的漏检风险。
[0006]现行的新型冠状病毒检测方法都存在一定的问题，影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。检测病毒抗体和血清学方法简单快速，但特异性差，灵敏度低，假阴性高，而且短期内很难获得病毒高质量特异性抗体，导致免疫学检测受到限制。病毒基因组测序检测时间长，对检测机构的技术能力和仪器条件要求比较高，导致病毒基因组测序技术不能大范围的推广应用，不能满足疫情实时检测的需要。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的
荧光定量PCR仪，无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针，检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情期间病毒快速检测的需要。
[0007]对于目前新型冠状病毒检测技术存在的问题主要在于：
[0008]一是目前新型冠状病毒检测技术各有优缺点。新型冠状病毒检测首选的病毒核酸检测方法，全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。实时荧光PCR方法的优点是相较于其他抗原抗体法(如胶体金技术)更为灵敏，检测结果更为准确，但是检测需要专业的仪器和分子检测实验室以及专业的操作人员，操作不当或者实验室条件不足可能会因气溶胶污染造成假阳性，且整个流程需要几个小时，相较于胶体金法时间更长。
[0009]病毒分离鉴定：病毒培养是诊断流感病毒感染的传统方法之一，但是传统的分离鉴定方法需要连续培养多天，敏感性和特异性都会低于核酸检测方法，虽然在前期确定侵害性病原物起到关键作用，但较为耗时，且不便捷，安全防护要求较高，不能满足大量疑似患者筛查需求。
[0010]免疫胶体金层析技术：虽然免疫胶体金层析技术操作简单，出结果快(一般为20分钟)，但是此方法敏感性较差，加入样本后的原理靠的是层析，也就是往外分散，如果材料等质量有误差，会影响检测结果；也会因为病人感染时间较短或者采样部位导致病毒含量较低，导致出现假阴性。另外，该方法由于依赖抗原抗体，对于前期开发时选择包被的抗原/抗体最为关键，短时间内开发出的产品有待确认其特异性和灵敏性。
[0011]二是新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量问题。试剂盒反转录效率低下；扩增的循环数不够；PCR长度/引物设计/引物的特异等都是影响试剂盒检测质量的重要影响因素。很多试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化、质控、灵敏度、特异性测试等等，所以导致灵敏度不够，检测的结果不稳定。病人要经常要做上三四次核酸检测，甚至是四五次的实验，才知道是阳性还是阴性。即便如此，可能还有很多人检测出来是阴性，但已经出现白肺了，症状明显是新冠炎的症状，但是核酸检测结果还是阴性，或者有些人核酸检测阳转阴了，但其实是假阴性。
[0012]三是目前新冠病毒核酸检测针对的位点主要是新冠病毒基因组中2段保守基因靶标，即：开放读码框1ab(Open reading frame 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)基因，其中N基因特异性不强，易产生交叉反应，临床上双结果不易研判，导致临床上需要反复进行复核操作。尚没有S蛋白基因检测方法及试剂盒。2月19日，国家卫生健康委员会与国家中医药管理局发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，为防治新冠肺炎提供了更加明确的指南，确诊病例需有病原学证据阳性结果(新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。
[0013]但目前在用的不同厂家荧光双位点定量PCR试剂盒普遍对于新冠病毒N蛋白基因的扩增敏感性高于ORF1ab检测，可能导致部分病毒含量较低的样本检测结果为单通道阳性；此外，由于N基因在新冠病毒的核酸序列中，其保守程度不及ORF1ab，故可能存在不同冠状病毒间有一定的交叉，导致N基因扩增阳性而ORF1ab阴性。对于临床上样本检测结果为单通道阳性的，需要谨慎对待，应采用同一检测方法的另一厂家试剂盒或采用目前实验室可
进行的另一检测方法对样本进行复核，如第二次结果为阴性，则报告阴性，并根据相应文件要求需间隔1天以上再次对同一病人进行取样检测，两次阴性结果可初步排除感染，但仍需结合临床症状及CT检查结果考虑进一步的核酸检测策略；而第二次结果仍为单通道阳性的样本，将建议临床重新取该患者样本送检。同时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组，其特征在于，其包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，所述外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。2.一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求1所述的引物组、链置换Bst DNA聚合酶和逆转录酶。3.根据权利要求2所述的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括钙黄绿素、dNTPs、KCl和MgCl2。4.根据权利要求2所述的恒温显色筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含S基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照，所述S基因体外转录RNA的序列如SEQ ID NO.7所示，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。5.一种用于2019新型冠状病毒检测的恒温显色方法，其特征在于，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取RNA；(2)对步骤(1)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，曹际娟，季超，郑秋月，孙金生，薛淑霞，闫春财，刘文彬，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：