本申请涉及用于SARS-CoV-2基因扩增的引物及试剂盒，其结合包括LAMP或RT-LAMP等在内的基因扩增体系，能够快速、简单、高特异性地确定COVID-19患者、无症状的携带者以及判断环境样本中是否存在SARS-CoV-2病毒等，无需复杂的仪器，并且可选地可以用肉眼读取测试结果，从而适用于大规模SARS-CoV-2病毒筛查。本申请还提供所述引物及试剂盒的使用方法及应用。提供所述引物及试剂盒的使用方法及应用。
【技术实现步骤摘要】
用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用
[0001]本申请涉及用于核酸检测的引物及其应用，特别是涉及用于SARS-CoV-2检测的引物、引物组、试剂盒、检测方法及应用等。
技术介绍
[0002]目前全球流行的新型冠状病毒SARS-CoV-2(亦被称为2019-nCoV、HCoV-19，下文称为
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新冠病毒
″
)已导致大量人群感染新型冠状病毒肺炎COVID-19(下文称为
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新冠肺炎
″
)。基于流行病学调查，COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。为了遏制病毒的传播，WHO迫切要求扩展对潜在患者筛查和检测。
[0003]病毒核酸检测，即检测病毒RNA，是一种行之有效的病毒检测方法。当前最常见的核酸诊断方法是基于实时RT-PCR检测新冠病毒核酸阳性。例如，中国的华大基因(BGI，https://www.bgi.com/kit)和美国疾控中心(CDC，https：//www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/about/testing.html)均提供试剂、引物和探针以支持对SARS-CoV-2进行RT-PCR诊断。目前，检测SARS-CoV-2的方法要么基于使用逆转录实时聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测病毒RNA本身，要么基于感染几天后出现于患者血液中的特异性免疫球蛋白IgM和IgG，这些现有方法要求实验室配备专门的检测仪器设备，由熟练的科学家和技术人员操作，并花费较长时间(约2个小时或以上)，因此，限制了核酸检测在当前对全球COVID-19大流行的巨大检测需求中的广泛应用。此外，现有的核酸检测试剂还存在假阴性比率较高(阳性检出率可低至30％～50％)的问题。
技术实现思路
[0004]基于此，需要一种快速、简单、特异性高的检测方式，以迅速准确地确定新冠肺炎患者(包括甚至尚未发生免疫反应的新冠肺炎患者)、无症状的携带者以及判断其他情形(如来自生活场所的环境样本)是否存在SARS-CoV-2病毒。
[0005]本申请的第一个方面，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为N15引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其核衣壳蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.1；反向引物：SEQ ID No.2；正向内引物：SEQ ID No.3；反向内引物：SEQ ID No.4；正向环引物：SEQ ID No.5；和反向环引物：SEQ ID No.6。
[0006]本申请的第二方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为O117引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其Orf1ab基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.7；反向引物：SEQ ID No.8；正向内引物：SEQ ID No.9；反向内引物：SEQ ID No.10；正向环引物：SEQ ID No.11；和反向环引物：SEQ ID No.12。
[0007]本申请的第三方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为N1引物组)，用于扩
增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其核衣壳蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.13；反向引物：SEQ ID No.14；正向内引物：SEQ ID No.15；反向内引物：SEQ ID No.16；正向环引物：SEQ ID No.17；和反向环引物：SEQ ID No.18。
[0008]本申请的第四方面中，提供一种寡核苷酸引物组(以下简称为S17引物组)，用于扩增SARS-CoV-2基因，特别是优选为其突刺蛋白基因区域，包括：正向引物：SEQ ID No.19；反向引物：SEQ ID No.20；正向内引物：SEQ ID No.21；反向内引物：SEQ ID No.22；正向环引物：SEQ ID No.23；和反向环引物：SEQ ID No.24。
[0009]在其中一些实施例中，上述任一种寡核苷酸引物组的正向内引物序列的5
’
端带有荧光标记。在其中一些实施例中，所述荧光标记为FAM。
[0010]本申请的第五方面中，还提供用于扩增SARS-CoV-2基因的引物组集合，其包括上述寡核苷酸引物组中的任意两种或两种以上的组合。
[0011]在其中一些实施例中，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合进行扩增的方式可以是本领域技术人员所知晓的任何基因扩增技术，例如包括但不限于，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、多重聚合酶链式反应(Multiplex PCR，mPCR)、实时或定量聚合酶链式反应(Real-Time/Quantitative PCR，qPCR)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA)和环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，以及反转录聚合酶链式反应(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、反转录多重聚合酶链式反应(RT-mPCR)、反转录实时或定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、反转录核酸序列依赖性扩增(RT-NASBA)和反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。
[0012]在其中一些实施例中，使用上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合进行扩增的方式是环介导等温扩增(LAMP)或反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。
[0013]本申请的第六方面中，还用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，该试剂盒包括上述任一种寡核苷酸引物组或引物组集合。
[0014]在其中一些实施例中，所述试剂盒包括的引物组为本申请第一方面和第二方面的引物组。
[0015]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶，并可选地包括pH指示剂。
[0016]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和反转录酶，并可选地包括pH指示剂。
[0017]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括具有RNA反转录酶和DNA聚合酶双重功能的单个酶。
[0018]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括基因扩增反应液或预混液、阴性对照、质控品和/或使用说明书。
[0019]在其中一些实施例中，所述基因扩增反应液包含水、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶)、缓冲、MgCl2；在一些实施例中，所述基因扩增反应液或预混液还可以包括反转录酶；可选地，所述基因扩增反应液或预混液还可以包括酶稳定剂、荧光染料(如电泳荧光染料)、pH指示剂等。
[0020]在其中一些实施例中，所述阴性对照为人肌动蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：正向引物：SEQ ID No.1；反向引物：SEQ ID No.2；正向内引物：SEQ ID No.3；反向内引物：SEQ ID No.4；正向环引物：SEQ ID No.5；和反向环引物：SEQ ID No.6。2.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：正向引物：SEQ ID No.7；反向引物：SEQ ID No.8；正向内引物：SEQ ID No.9；反向内引物：SEQ ID No.10；正向环引物：SEQ ID No.11；和反向环引物：SEQ ID No.12。3.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：正向引物：SEQ ID No.13；反向引物：SEQ ID No.14；正向内引物：SEQ ID No.15；反向内引物：SEQ ID No.16；正向环引物：SEQ ID No.17；和反向环引物：SEQ ID No.18。4.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，包括：正向引物：SEQ ID No.19；反向引物：SEQ ID No.20；正向内引物：SEQ ID No.21；反向内引物：SEQ ID No.22；正向环引物：SEQ ID No.23；和反向环引物：SEQ ID No.24。5.寡核苷酸引物组，用于扩增SARS-CoV-2基因，其具有根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸引物组的序列，且其中所述正向内引物序列的5
’
端带有荧光标记。6.用于扩增SARS-CoV-2基因的引物组集合，其包括根据权利要求1-5所述的寡核苷酸引物组中的任意两种或两种以上的组合。7.用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其包括根据权利要求1-5中任一项所述寡核苷酸引物组或根据权利要求6所述的引物组集合。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括的引物组为根据权利要求1所述的引物组和根据权利要求2所述的引物组，且所述引物组分别独立地在其正向内引物序列5
’
端携带或不携带荧光标记。9.根据权利要求7所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔占峰，黄巍，王允，王珲，
申请(专利权)人：牛津大学苏州科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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