本发明专利技术公开了一种登革病毒分型检测用的多重实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒及试剂盒的使用方法。从引物探针设计入手，设计了一对通用扩增引物，并搭配4条特异性探针，以此建立检测体系实现对登革病毒的4重分型核酸检测系统。通过在多重的检测体系中减少引物的使用，引物保守，探针特异，在保证分型特异性准确的前提下，提高多重核酸检测体系的检测灵敏度。使用本发明专利技术登革病毒分型检测用的PCR引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法可以同时检测登革病毒1型、2型、3型和4型，通过使用实时荧光PCR技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，可以快速、准确的得到检测结果。准确的得到检测结果。准确的得到检测结果。
【技术实现步骤摘要】
登革病毒分型检测用的多重实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种用于登革病毒分型的多重实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
技术介绍
[0002]登革热由登革病毒(dengue virus，DENV)感染引起的一种急性虫媒传染病，分布于全球的热带和亚热带地区。2019年初被世界卫生组织列为2019年全球健康十大威胁之一。DENV属黄病毒科黄病毒属，RNA长约11kb，依抗原性不同分为四个血清型(DENV1
‑
4)，各血清型的核苷酸序列差异为30％
‑
40％。每个血清型都可引起从普通登革热到致死性登革休克综合征等一系列广泛的临床疾病谱。目前有观点认为登革病毒某些血清型比其他型有更强的毒力，更容易感染细胞和引起更严重的疾病，临床流行病学观察也发现DENV
‑
2和DENV
‑
3比DENV
‑
1和DENV
‑
4更易引发重症；另外，因为二次异型登革病毒感染时存在抗体依赖的感染增强效应，需密切监测登革病毒各血清型流行和分布情况。
[0003]实时荧光定量RT
‑
PCR以其反应迅速、特异性强、灵敏性高等优点在病毒感染早期的检测中具有巨大优势，而基于Taqman探针技术的RT
‑
PCR成熟稳定，已广泛应用于多种病原体检测。
技术实现思路
[0004]本专利技术旨在提供一种登革病毒分型检测用的多重实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法，在多重的检测体系中减少引物的使用，通过引物保守，探针特异，在保证分型特异性准确的前提下，提高多重核酸检测体系的检测灵敏度，本专利技术提供的引物、探针、试剂盒及试剂盒的使用方法扩增效率高、成本低、操作简单、更易于推广，具有高度的准确性。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种登革病毒分型检测用的引物和探针，包括登革病毒扩增通用引物对、登革病毒1型检测探针、登革病毒2型检测探针、登革病毒3型检测探针、登革病毒4型检测探针。
[0007]优选的，所述革病毒扩增通用引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和/或是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的相似序列或互补序列；
[0008]GCTTAACGTAGTTCTAACAGTTT(SEQ ID NO.1)；
[0009]GTTTCTCGCGCGTTTCAGCATA(SEQ ID NO.2)；
[0010]所述登革病毒1型检测探针的序列如SEQ ID NO.3，和/或是SEQ ID NO.3所示序列的相似序列或互补序列；
[0011]ACCAACGGAAAAAGACGGCTCGACCGT(SEQ ID NO.3)；
[0012]所述登革病毒2型检测探针的序列如SEQ ID NO.4，和/或是SEQ ID NO.4所示序列
的相似序列或互补序列；
[0013]AACGGAAAAAGGCGAGAAATACGCCT(SEQ ID NO.4)；
[0014]所述登革病毒3型检测探针的序列如SEQ ID NO.5，和/或是SEQ ID NO.5所示序列的相似序列或互补序列；
[0015]ACGGAAAAAGACGGGAAAACCGTCTATC(SEQ ID NO.5)；
[0016]所述登革病毒4型检测探针的序列如SEQ ID NO.6，和/或是SEQ ID NO.6所示序列的相似序列或互补序列；
[0017]ACGAAAAAAGGTGGTTAGACCACCTTTC(SEQ ID NO.6)。
[0018]优选的，所述各检测探针的两端分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述登革病毒1型检测探针、登革病毒2型检测探针、登革病毒3型检测探针、登革病毒4型检测探针上标记的荧光基团各不相同。
[0019]优选的，所述登革病毒1型检测探针的5
’
端标记有荧光基团FAM，3
’
端标记有淬灭基团BHQ1；
[0020]所述登革病毒2型检测探针5
’
端标记有荧光基团VIC，3
’
端标记有淬灭基团BHQ1；
[0021]所述登革病毒3型检测探针5
’
端标记有荧光基团ROX，3
’
端标记有淬灭基团BHQ2；
[0022]所述登革病毒4型检测探针5
’
端标记有荧光基团Cy5，3
’
端标记有淬灭基团BHQ2。
[0023]本专利技术的第二个目的是提供一种登革病毒分型检测用的试剂盒，含有上述所述的流感病毒分型检测用的引物和探针。
[0024]优选的，所述试剂盒还包括含有核酸扩增试剂；
[0025]所述核酸扩增试剂包括DENV
‑
Type扩增反应液(冻干粉)、DENV阳性对照和稀释液；
[0026]所述DENV
‑
Type扩增反应液包括Mg
2+
、DNA聚合酶、dNTPs和登革病毒分型检测用的引物和探针；
[0027]所述DENV阳性对照为由经过灭活后的登革病毒1型阳性血清、登革病毒2型阳性血清、登革病毒3型阳性血清、登革病毒4型三种标准毒株混合而成；
[0028]所述稀释液为无菌水。
[0029]本专利技术的第三个目的是提供一种登革病毒分型试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0030]S1、提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
[0031]S2、取出DENV
‑
Type扩增反应液(冻干粉)，短暂高速离心，使用稀释液复溶，振荡混匀并放置2分钟后待用，然后按20μL/管分装到透明PCR八排管或96孔PCR反应板中，转移至样本处理区；
[0032]S3、分别加入5μL处理好的样本核酸、阴性对照(稀释液)以及阳性对照，盖好管盖，转移至核酸扩增区；
[0033]S4、在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
[0034]优选的，所述检测荧光信号的判断标准如下：
[0035]所述阴性对照需在各通道荧光素下荧光信号均无明显增长，且无明显S型扩增曲线；
[0036]所述DENV阳性对照需在FAM，VIC，ROX和Cy5荧光素下荧光信号均有明显增长，有典型的S型曲线，且各通道Ct值≤37.00；
[0037]若在检测样品中荧光基团FAM下通道Ct值≤37.00，检测结果为登革病毒1型核酸检测阳性；
[0038]若在检测样品中荧光基团VIC下通道Ct值≤37.00，检测结果为登革病毒2型核酸检测阳性；
[0039]若在检测样品中荧光基团ROX下通道Ct值≤37.00，检测结果为登革本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种登革病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，包括登革病毒扩增通用引物对、登革病毒1型检测探针、登革病毒2型检测探针、登革病毒3型检测探针、登革病毒4型检测探针。2.根据权利要求1所述登革病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，所述革病毒扩增通用引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和/或是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的相似序列或互补序列；所述登革病毒1型检测探针的序列如SEQ ID NO.3，和/或是SEQ ID NO.3所示序列的相似序列或互补序列；所述登革病毒2型检测探针的序列如SEQ ID NO.4，和/或是SEQ ID NO.4所示序列的相似序列或互补序列；所述登革病毒3型检测探针的序列如SEQ ID NO.5，和/或是SEQ ID NO.5所示序列的相似序列或互补序列；所述登革病毒4型检测探针的序列如SEQ ID NO.6，和/或是SEQ ID NO.6所示序列的相似序列或互补序列。3.根据权利要求1所述登革病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，所述各检测探针的两端分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述登革病毒1型检测探针、登革病毒2型检测探针、登革病毒3型检测探针、登革病毒4型检测探针上标记的荧光基团各不相同。4.根据权利要求1所述登革病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，所述登革病毒1型检测探针的5
’
端标记有荧光基团FAM，3
’
端标记有淬灭基团BHQ1；所述登革病毒2型检测探针5
’
端标记有荧光基团VIC，3
’
端标记有淬灭基团BHQ1；所述登革病毒3型检测探针5
’
端标记有荧光基团ROX，3
’
端标记有淬灭基团BHQ2；所述登革病毒4型检测探针5
’
端标记有荧光基团Cy5，3
’
端标记有淬灭基团BHQ2。5.一种登革病毒分型检测用的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的流感病毒分型检测用的引物和探针。6.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵令斋，高小龙，张复春，
申请(专利权)人：广东和信健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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