一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种苯丙酮单加氧酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列通过突变获得，并公开基于该苯丙酮单加氧酶的不对称生物催化合成亚砜类药物的技术方法。本发明专利技术通过基因挖掘筛选获得来源于Limnobacter sp.的苯丙酮单加氧酶基因，采用基因工程技术构建重组大肠杆菌表达菌株，通过分子改造技术实现酶活力和立体选择性的提高。同时构建了单加氧酶突变体与不同脱氢酶的共表达菌株。以奥美拉唑硫醚为原料，采用全细胞或酶蛋白催化的方法，不对称催化合成光学纯埃索美拉唑。本发明专利技术可以在温和的条件下通过一步反应获得目标产物，没有副产物奥美拉唑砜，同时环境友好，是一种绿色生物催化合成途径。物催化合成途径。

【技术实现步骤摘要】
一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用


[0001]本专利技术属于生物制药和生物化工
，具体涉及一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用。

技术介绍

[0002]埃索美拉唑，又称艾司奥美拉唑或(S)
‑
奥美拉唑，化学名为5
‑
甲氧基
‑2‑
((S)
‑
((4
‑
甲氧基
‑
3, 5
‑
二甲基
‑2‑
吡啶基)甲基)亚硫酰基)
‑
1H
‑
苯并咪唑，化学结构如下所示。埃索美拉唑是奥美拉唑的(S)
‑
单一构型异构体，主要用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡、胃炎以及消化道食管炎，临床上已经证明该药比外消旋体和(R)
‑
奥美拉唑或其它拉唑类药物毒副作用更低，疗效更好。制备埃索美拉唑化学法是利用金属催化剂不对称氧化硫醚合成埃索美拉唑，但这类方法存在光学纯度受限、容易过度氧化、副产物多、分离提纯工艺复杂等缺点。
[0003]埃索美拉唑结构式目前生物催化合成光学纯埃索美拉唑的单加氧酶突变体均来自于不动杆菌Acinetobacter sp.环己酮单加氧酶（CHMO） (J Org Chem 2018, 83, 7453
‑
7458； ACS Sustain Chem Eng, 2019, 7, 7218
‑
7226)。已公布的专利CN 111218431 A和CN102884178A主要采用随机突变和定向进化的方式改造CHMO，获得不对称氧化奥美拉唑硫醚的高活性CHMO 突变体。但是反应产物含有一定量可检测到的过氧化副产物奥美拉唑砜。目前未见对苯丙酮具有氧化活性的苯丙酮单加氧酶（PAMO）催化不对称合成光学纯埃索美拉唑或其它拉唑化合物的报道。同时上述专利均采用游离酶反应，需要额外添加甲酸脱氢酶或羰基还原酶实现辅酶NADPH再生，有专利（CN 108239618 A）报道单加氧酶与羰基还原酶（或称异丙醇脱氢酶）共表达用于埃索美拉唑合成，但是对单加氧酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶共表达未见报道，不同脱氢酶在大肠杆菌内表达水平存在差异，而且不同单加氧酶与脱氢酶共表达组合及共表达方式直接影响单加氧酶可溶性表达和辅酶再生，进而导致生物催化法合成埃索美拉唑的整体效率出现差异。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用。通过基因挖掘从一株Limnobacter sp.菌基因组中获得苯丙酮单加氧酶LnPAMO，其氨基酸序列与目前已报道的合成埃索美拉唑的CHMO单加氧酶序列同源性低（≤40%）。通过对该酶氨基酸序列的定点突变及基因工程改造，含苯丙酮单加氧酶LnPAMO的菌体实现了全细胞催化不对称合成光学纯埃索美拉唑埃索美拉唑。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
一种苯丙酮单加氧酶基因，所述苯丙酮单加氧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]一种苯丙酮单加氧酶，所述苯丙酮单加氧酶包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变体，所述突变体的突变方式包括指定位置的氨基酸残基突变，所述指定位置选自如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第59位，第112位，第121位，第152位，第246位，第251位，第252位，第279位，第284位，第328位，第329位，第436位，第438位，第488位及第495位氨基酸。
[0007]进一步的，上述指定位置的氨基酸残基突变包括以下任意一种或几种突变方式：突变体格式XnY/Z，表示第n位氨基酸残基X替换为氨基酸残基Y或者氨基酸残基Z；具体包括：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L及Y495I。
[0008]所述突变体指定位置的氨基酸残基突变包括所述指定一个或多个位置氨基酸残基替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：更进一步的，上述突变体指定位置的氨基酸残基突变包括所述指定一个或多个位置的氨基酸残基替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种突变方式：单点突变体MU1；Y495I；两点突变体MU2：K329L，Y495I；三点突变体MU3：I246H，K329L，Y495I；四点突变体MU4：I246H，T252E，K329L，Y495I；五点突变体MU5：I59L，I246H，T252E，K329L，Y495I；六点突变体MU6：I59L，I246H，T252E，I279L，K329L，Y495I；七点突变体MU7：I59L，I246H，T252E，I279L，A328L，K329L，Y495I；八点突变体MU8：I59L，246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，Y495I；九点突变体MU9：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，F488L，Y495I；十点突变体MU
10
：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十一点突变体MU
11
：I59L，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十二点突变体MU
12
：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十三点突变体MU
13
：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；十四点突变体MU
14
：I59L，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；十五点突变体MU
15
：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I。
[0009]一种重组表达质粒，所述重组表达质粒能表达上述苯丙酮单加氧酶。
[0010]进一步的，将苯丙酮单加氧酶突变体基因，或者脱氢酶基因和苯丙酮单加氧酶突变体基因，连接至质粒pET28a上构建重组表达质粒；所述脱氢酶包括甲酸脱氢酶基因、葡萄
糖脱氢酶、羰基还原酶中的一种；构建的重组表达质粒包括pET28a
‑
PAMO
‑
MU
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苯丙酮单加氧酶基因，其特征在于：所述苯丙酮单加氧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种苯丙酮单加氧酶，其特征在于：所述苯丙酮单加氧酶包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变体，所述突变体的突变方式包括指定位置的氨基酸残基突变，其指定位置的氨基酸残基突变包括以下任意一种或几种突变方式，突变体格式XnY/Z，表示第n位氨基酸残基X替换为氨基酸残基Y或者氨基酸残基Z；具体包括： I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L及Y495I。3.根据权利要求2所述的一种苯丙酮单加氧酶，其特征在于：所述突变体指定位置的氨基酸残基突变包括所述指定位置一个或多个氨基酸残基替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：单点突变体MU1；Y495I；两点突变体MU2：K329L，Y495I；三点突变体MU3：I246H，K329L，Y495I；四点突变体MU4：I246H，T252E，K329L，Y495I；五点突变体MU5：I59L，I246H，T252E，K329L，Y495I；六点突变体MU6：I59L，I246H，T252E，I279L，K329L，Y495I；七点突变体MU7：I59L，I246H，T252E，I279L，A328L，K329L，Y495I；八点突变体MU8：I59L，246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，Y495I；九点突变体MU9：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，F488L，Y495I；十点突变体MU
10
：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十一点突变体MU
11
：I59L，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十二点突变体MU
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：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；十三点突变体MU
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：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；十四点突变体MU
14
：I59L，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；十五点突变体MU
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：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L，Y495I。4.一种重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒能表达权利要求3所述的苯丙酮单加氧酶。5.根据权利要求4所述的一种重组表达质粒，其特征在于：将苯丙酮单加氧酶突变体基因，或者苯丙酮单加氧酶突变体基因和脱氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，许鑫琦，张娅娇，许炼，苏冰梅，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：