一种创制地黄杂合突变体的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明专利技术所述的CRISPR/Cas9系统靶向地黄RgPDS1基因，RgPDS1基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶位点序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术根据靶序列合成一对互补的上下游引物；引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，进一步筛选出构建成功的重组质粒；将重组质粒转化根癌农杆菌，采用叶盘法遗传转化技术侵染地黄外植体并获得杂合突变体植株。首次实现了利用CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中创制杂合突变体，为加速地黄分子育种进程，品种改良及种质资源的创新提供新的研究手段，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。控基因的功能。控基因的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种创制地黄杂合突变体的方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种创制地黄杂合突变体的方法及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统是广泛应用于生物体目标DNA修饰的基因编辑技术之一，其由gRNA与Cas9两部分组成。CRISPR/Cas9技术具有构建方法简单、应用范围广、编辑效率高和成本低等优点。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于拟南芥、水稻、大豆、番茄等作物中，而在药用植物中的应用还较少。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，PDS基因常被作为一种标记基因用于CRISPR/Cas9系统的适用性研究。
[0003]地黄（Rehmannia glutinosa）作为常用的大宗药材，为著名的“四大怀药”之一。其块根鲜品入药为鲜地黄（生地黄），能够清热生津、凉血、止血；经炮制后的地黄块根入药称熟地黄，能够滋阴补血，益精填髓。地黄中含有丰富的药用活性成分，如梓醇、地黄苷A、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：地黄总RNA的提取与反转录：取地黄块根鲜样置于液氮中冷冻后研磨，进行总RNA的提取，然后将提取的RNA反转录合成cDNA；地黄PDS基因的克隆：以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因作为CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板进行目的基因的克隆；靶位点的设计：根据PDS基因的序列在RgPDS1基因上设计靶位点，所述的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示；构建地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体：根据靶序列信息合成一对反向互补的上下游引物，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的sgPDS_F和SEQ ID NO.4所示的sgPDS_R，根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体；获得地黄杂合突变体：将重组载体转化农杆菌，并对地黄外植体进行遗传转化获得突变植株。2.如权利要求1所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丰青，左鑫，李欣容，孙瑞斌，孙红正，苗春妍，杜家方，李烜桢，黄勇，张重义，
申请(专利权)人：焦作市玖道种苗繁育有限公司，
类型：发明
国别省市：