一种创制地黄杂合突变体的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明专利技术所述的CRISPR/Cas9系统靶向地黄RgPDS1基因，RgPDS1基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶位点序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术根据靶序列合成一对互补的上下游引物；引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，进一步筛选出构建成功的重组质粒；将重组质粒转化根癌农杆菌，采用叶盘法遗传转化技术侵染地黄外植体并获得杂合突变体植株。首次实现了利用CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中创制杂合突变体，为加速地黄分子育种进程，品种改良及种质资源的创新提供新的研究手段，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。控基因的功能。控基因的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种创制地黄杂合突变体的方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种创制地黄杂合突变体的方法及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统是广泛应用于生物体目标DNA修饰的基因编辑技术之一，其由gRNA与Cas9两部分组成。CRISPR/Cas9技术具有构建方法简单、应用范围广、编辑效率高和成本低等优点。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于拟南芥、水稻、大豆、番茄等作物中，而在药用植物中的应用还较少。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，PDS基因常被作为一种标记基因用于CRISPR/Cas9系统的适用性研究。
[0003]地黄（Rehmannia glutinosa）作为常用的大宗药材，为著名的“四大怀药”之一。其块根鲜品入药为鲜地黄（生地黄），能够清热生津、凉血、止血；经炮制后的地黄块根入药称熟地黄，能够滋阴补血，益精填髓。地黄中含有丰富的药用活性成分，如梓醇、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷等，在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗高血压、提高免疫力等方面具有重要的药理活性。然而，由于地黄长期进行无性繁殖，病虫害种类多，品种退化严重。而且地黄的基因组高度杂合，遗传基础狭窄，自交不亲和性，无法获得自交种子从而很难获得纯系。因此，地黄育种进程缓慢，新品种少，制约了地黄的规范化、产业化生产。基因编辑技术在克服植物自交不亲和、遗传改良和野生驯化等方面具有非常大的应用潜力，因此，基因编辑技术有利于推动地黄的种质创新和新品种培育，同时可以大大促进地黄的功能基因组学研究。然而，目前还未见关于CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中的应用研究。
[0004]在植物生长发育中一些具有重要功能的基因纯合突变往往导致植株无法存活，而杂合突变仅仅降低了功能基因的作用使植株能够存活，便于分析目标基因部分缺失的遗传效应，有利于致死性基因的分子功能研究。对于生产上以无性繁殖为主的药用植物而言，杂合突变材料可以通过无性繁殖进行保存和扩大种植，目标基因的杂合突变体具有在生产上直接利用的潜力，为中药材的生产提供优异种质材料。目前植物基因编辑常用花序、悬浮细胞、胚性愈伤组织为遗传转化的受体，获得的纯合突变体所占比例高。本专利技术利用根癌农杆菌介导的叶盘法对CRISPR/Cas9基因编辑载体进行转化，首次实现了对地黄基因组DNA靶序列进行遗传修饰，并成功获得了高比例的目标基因的杂合突变体，对地黄的功能基因组学研究奠定了基础，而且为地黄的种质资源创新和新品种选育提供新的途径。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，在地黄中首次实现利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑地黄PDS基因，并成功获得pds基因突变的杂合突变体植株，为地黄遗传改良、种质资源创新、野生种质驯化和新品种选育等研究提供新的技术支持。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种创制地黄杂合突变体的方法，包括以下步骤：（1）地黄总RNA的提取与反转录：取地黄块根鲜样置于液氮中冷冻后研磨，进行总RNA的提取，然后将提取的RNA反转录合成cDNA；（2）地黄PDS基因的克隆：以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因作为CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板进行目的基因的克隆；（3）靶位点的设计：根据PDS基因的序列在RgPDS1基因上设计靶位点，所述的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示；（4）构建地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体：根据靶序列信息合成一对反向互补的上下游引物，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的sgPDS_F和SEQ ID NO.4所示的sgPDS_R，根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体；（5）获得地黄杂合突变体：将重组载体转化农杆菌，并对地黄外植体进行遗传转化获得突变植株。
[0007]进一步的，所述步骤（2）中RgPDS1_F和RgPDS1_R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示。
[0008]进一步的，所述步骤（4）中根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体的具体操作为，将上下游引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，再次筛选出构建成功的重组质粒。
[0009]进一步的，所述靶序列引物包含Bsal I内切酶粘性末端。
[0010]进一步的，所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404。
[0011]一种创制地黄杂合突变体的方法中利用靶位点或靶位点序列引物制备得到的CRISPR/Cas9系统用载体。
[0012]一种创制地黄杂合突变体的方法中CRISPR/Cas9载体在敲除地黄PDS基因并获得pds基因突变的杂合突变体中的应用。
[0013]一种利用CRISPR/Cas9系统创制地黄杂合突变体的方法在地黄pds基因杂合突变体表型分析与类胡萝卜素含量测定中的应用。
[0014]专利技术原理：本专利技术利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑地黄的PDS基因；利用在线网站根据PDS基因序列设计靶位点，根据靶位点序列合成一对互补的且含有Bsal I粘性末端的上下游引物；引物退火形成双链，通过酶切连接法构建含PDS靶序列的CRISPR/Cas9载体；将重组载体转化感受态大肠杆菌DH 5α，经菌液PCR鉴定与测序验证；将已鉴定的含正确靶序列的载体转化农杆菌，并保存菌株；菌株进行活化培养后，采用叶盘法遗传转化技术对地黄外植体进行侵染，进一步共培养、筛选培养后获得转基因植株。其中获得的转基因植株中含有杂合表型的pds基因突变体。提取这些杂合体植株DNA进行TA克隆测序，测序结果进一步显示PDS基因靶位点发生突变，其突变类型主要是碱基的缺失，然后是插入和替换。
[0015]本专利技术具有的优点是：本专利技术公布了一种利用CRISPR/Cas9系统通过叶盘法遗传转化技术侵染地黄，并获得地黄杂合突变体的方法，选择地黄PDS基因作为靶基因，并公布
了地黄PDS基因的核苷酸序列，根据序列信息设计靶位点及引物的合成，并将其重组构建于CRISPR/Cas9系统，首次实现了基因编辑技术在地黄中的应用并成功获得地黄杂合突变体，为进一步挖掘功能基因、改良地黄种质、加速新品种选育等研究工作的开展提供新的研究途径，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。
附图说明
[0016]图1是地黄PDS基因靶位点设计示意图；图2是pKSE401
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PDS重组质粒构建图；图3是地黄PDS基因叶盘法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：地黄总RNA的提取与反转录：取地黄块根鲜样置于液氮中冷冻后研磨，进行总RNA的提取，然后将提取的RNA反转录合成cDNA；地黄PDS基因的克隆：以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因作为CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板进行目的基因的克隆；靶位点的设计：根据PDS基因的序列在RgPDS1基因上设计靶位点，所述的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示；构建地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体：根据靶序列信息合成一对反向互补的上下游引物，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的sgPDS_F和SEQ ID NO.4所示的sgPDS_R，根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体；获得地黄杂合突变体：将重组载体转化农杆菌，并对地黄外植体进行遗传转化获得突变植株。2.如权利要求1所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丰青，左鑫，李欣容，孙瑞斌，孙红正，苗春妍，杜家方，李烜桢，黄勇，张重义，
申请(专利权)人：焦作市玖道种苗繁育有限公司，
类型：发明
国别省市：