一种烟草过氧化物酶相关的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种烟草过氧化物酶相关的基因及应用，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的烟草过氧化物酶相关的基因NtPOD7，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtPOD7基因获得在抗逆胁迫下表达量降低的基因编辑植株，通过荧光定量PCR发现，在正常条件下，所获基因编辑植株的NtPOD7基因表达量与对照植株相比无明显差异；但在干旱胁迫、盐胁迫条件下，基因编辑植株的NtPOD7基因表达量明显低于对照植株，这为烟草过氧化物酶研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。性研究提供遗传材料和理论依据。性研究提供遗传材料和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草过氧化物酶相关的基因及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种烟草过氧化物酶相关的基因及其应用。

技术介绍

[0002]植物过氧化物酶由大量超家族基因编码，从植物细胞分泌或通过内质网(ER)转运到液泡中。在植物中，过氧化物酶起着多种生物学作用，过氧化物酶是一种在植物中广泛存在的氧化还原酶，在植物正常生长和应激反应中发挥着重要作用，是植物重要的保护酶类，最常见的是III类分泌过氧化物酶，其生物学功能是催化除去H2O2，并参与有毒还原剂的氧化、木质素的生物合成和降解和植物形态建成等，并参与环境胁迫响应如伤害、病原体攻击和氧化应激反应等。由于过氧化物酶在植物中的生理重要作用，已成为广泛的生化和分子生物学研究的主题。
[0003]过氧化物酶在应对非生物和生物环境压力时表现出多种表达模式，例如机械损伤，乙烯，病原体感染，干旱，低温，光照和植物生长调节剂。在辣椒中过氧化物酶基因CanPOD，其在辣椒的不同组织中显示出不同的表达水平，结果表明，辣椒疫霉能显着诱导CanPOD；在盐和干旱胁迫处理后，叶片中的CanPOD也被上调；信号激素水杨酸(SA)强烈诱导CanPOD表达。CanPOD参与辣椒植物对辣椒疫霉菌感染的防御反应以及非生物胁迫。
[0004]烟草作为我国重要的经济作物和模式作物，研究烟草过氧化物酶基因响应非生物逆境胁迫的分子机制具有重要意义。在烟草过氧化物酶基因克隆与功能研究方面，有研究者分别从烤烟品种K326和普通烟草中克隆出了属于III类分泌过氧化物酶的烟草过氧化物酶基因NtPOD1和Ntpx。这两个基因在根、茎、叶、花中均有表达。同时也受高盐、干旱及ABA等植物激素显著诱导。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草过氧化物酶相关的基因及其应用，为研究烟草抗逆能力与基因功能提供遗传材料和理论依据。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种烟草过氧化物酶相关的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括960bp个碱基，该基因来源于烟草(Nicotiana tabacum，命名为NtPOD7)。
[0008]优选的，所述烟草过氧化物酶相关的基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括319个氨基酸。
[0009]本专利技术还提供上述烟草过氧化物酶的基因在烟草抗逆方面的应用。将该基因编辑后，烟草在种子萌发苗期对于盐胁迫、干旱胁迫具有一定抗性。通过实时荧光定量PCR发现，在正常条件下，所获基因编辑植株的NtPOD7基因表达量与对照(未转化)植株相比无明显差异；但在干旱胁迫、盐胁迫条件下，基因编辑植株的NtPOD7基因表达量明显低于对照植株。这为基因功能的研究将为烟草遗传改良提供遗传材料和理论依据。
[0010]本专利技术的有益效果是：
[0011]本专利技术通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtPOD7基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtPOD7基因发生编辑的红花大金元植株。本专利技术通过在种子萌发苗期进行不同程度干旱胁迫、盐胁迫处理，发现NtPOD7基因编辑植株在干旱胁迫、盐胁迫处理条件下，生长(地上部分、根长)均明显优于对照(未转化)植株。
[0012]本专利技术提供的烟草过氧化物酶相关的基因NtPOD7，通过荧光定量PCR发现，在正常条件下，所获基因编辑植株的NtPOD7基因表达量与对照(未转化)植株相比无明显差异；但在干旱胁迫、盐胁迫条件下，基因编辑植株的NtPOD7基因表达量明显低于对照植株。
[0013]综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtPOD7基因获得在抗逆胁迫下表达量降低的基因编辑植株，这为烟草过氧化物酶研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。
附图说明
[0014]图1为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发苗期在不同浓度及处理条件下(干旱胁迫、盐胁迫)对比图，其中(A)为培养皿分布示意图，(B)干旱胁迫对照图，(C)为盐胁迫对照图；
[0015]图2为对照(未转化)植株叶片和基因编辑植株叶片在不同处理条件下(对照、干旱胁迫、盐胁迫)中NtPOD7的相对表达量。
具体实施方式
[0016]以下通过实施例来详细说明本专利技术的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本专利技术的技术方案，而不能解释为是对本专利技术技术方案的限制。
[0017]在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0018]本专利技术除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
[0019]本申请中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。
[0020]实施例1
[0021]本实施例主要就烟草过氧化物酶相关的基因NtPOD7的获得过程，简要介绍如下。
[0022]以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：
[0023]按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。
[0024]1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：
[0025]Total RNA 1μg
[0026]Oligo(dT)(10μM)1.5μL
[0027]ddH2O up to 15μL
[0028]将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
[0029][0030]上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于
‑
20℃冰箱中保存使用。
[0031]通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
[0032]F：5
’‑
CCCTTCAAAGTAATATATTTCT
‑3’
，(SEQ ID No.3)
[0033]R：5
’‑
TTAGTTGATCCTCCTGCAATTCTTCC
‑3’
；(SEQ ID No.4)
[0034]以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：
[0035]扩增体系(50μL)：
[0036][0037]混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃10min；12℃Hold。
[0038]对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草过氧化物酶相关的基因NtPOD7序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括960bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括319个氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草过氧化物酶相关的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的烟草过氧化物酶相关的基因，其特征在于，所述烟草过氧化物酶相关的基因的编码蛋白。3.根据权利要求2所述的烟草过氧化物酶相关的基因，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.上述任一项烟草过氧化物酶相关的基因的应用，其特征在于，基因编辑烟草过氧化物酶基因获得植株具有对干旱胁迫与盐胁迫的抗性。5.根据权利要求4所述的烟草过氧化物酶相关的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：许力，高茜，许永，曾婉俐，蒋佳芮，李雪梅，李正风，向海英，刘欣，杨文武，邓乐乐，张建铎，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：