用于产生己二酸和其他化合物的微生物制造技术

本发明专利技术提供了一种非天然存在的微生物生物体，其具有己二酸、6

【技术实现步骤摘要】
用于产生己二酸和其他化合物的微生物
[0001]本申请是申请日为2009年3月27日、优先权日为2008年3月27日、申请号为201610472390.1、专利技术名称为“用于产生己二酸和其他化合物的微生物”的专利技术专利申请的分案申请。其中申请号为201610472390.1的专利技术专利申请是申请日为2009年3月27日、优先权日为2008年3月27日、申请号为201310408211.4、专利技术名称为“用于产生己二酸和其他化合物的微生物”的专利技术专利申请的分案申请。其中，申请号为201310408211.4的专利技术专利申请是申请日为2009年3月27日、优先权日为2008年3月27日、申请号为200980119404.X、专利技术名称为“用于产生己二酸和其他化合物的微生物”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求于2008年3月27日申请的美国临时系列号61/040,059的优先权权益，该申请的全部内容通过引用合并于此。


[0003]本专利技术总体上涉及生物合成方法，且更具体地涉及具有己二酸、6
‑
氨基己酸和己内酰胺生物合成能力的生物体。

技术介绍

[0004]己二酸，一种分子量为146.14的二羧酸，是一种具有商业意义的化合物。其主要用途是制备尼龙6,6，一种通过将己二酸与环己二胺缩合制备的线性聚酰胺，其主要用于制造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包括其在增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇中的用途。其他用途包括用于制备聚氨酯、润滑剂组分，和作为调味剂和胶凝助剂用作食品成分。
[0005]过去，己二酸使用氧化作用由各种脂肪制备。目前用于己二酸合成的商业方法依靠使用过量的浓硝酸氧化KA油——一种环己酮(酮或K组分)和环己醇(醇或A组分)的混合物，或氧化纯环己醇。此方案有几种变型，其区别在于产生KA或环己醇的途径。例如，苯酚是KA油制备中的替代原料，并且已经描述了用于从苯酚合成己二酸的方法。此方法的其他方式倾向于使用除硝酸以外的氧化剂，诸如过氧化氢、空气或氧。
[0006]己内酰胺是一种有机化合物，其是6
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氨基己酸(ε
‑
氨基己酸、氨基己酸)的内酰胺。或者其可以被认为是己酸的环酰胺。己内酰胺的主要工业应用是作为制备尼龙
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6的单体。大多数己内酰胺使用硫酸羟铵经肟化方法然后使用Beckmann重排工艺步骤通过催化重排合成自环己酮。
[0007]因此，存在着用于有效地制备商业数量的化合物诸如己二酸和己内酰胺的可替代方法的需求。本专利技术满足了这种需求并还提供了相关的优势。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了具有己二酸、6
‑
氨基己酸或己内酰胺途径的非天然存在的微生物生物体。该微生物生物体含有至少一种编码己二酸、6
‑
氨基己酸或己内酰胺途径中各自的酶的外源性核酸。本专利技术还提供了一种产生己二酸、6
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氨基己酸或己内酰胺的方法。该方法可以包括在产生己二酸、6
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氨基己酸或己内酰胺的条件下和足以产生己二酸、6
‑
氨基己酸或
己内酰胺的时间内培养产生己二酸、6
‑
氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体，其中所述微生物生物体以足以产生各自产物的量表达至少一种编码己二酸、6
‑
氨基己酸或己内酰胺途径酶的外源性核酸。
附图说明
[0009]图1显示在产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的过氧化酶体中降解己二酸的示例性途径。
[0010]图2显示经逆降解途径形成己二酸的示例性途径。对于己二酰
‑
CoA至己二酸的最终转变提供了几种选择。
[0011]图3显示经3
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氧代己二酸途径形成己二酸的示例性途径。
[0012]图4显示己二酸合成和还原性TCA循环的3
‑
氧代己二酸途径的最后三个步骤的类似酶化学。
[0013]图5显示经顺,顺
‑
己二烯二酸从葡萄糖合成己二酸的示例性途径。生物合成中间体(缩写):D
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赤藓糖4
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磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯庚酮糖酸7
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磷酸(DAHP)、3
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脱氢奎尼酸(DHQ)、3
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脱氢莽草酸(DHS)、原儿茶酸(PCA)。酶(编码基因)或反应条件：(a)DAHP合成酶(aroFFBR)、(b)3
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脱氢奎尼酸合成酶(aroB)、(c)3
‑
脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)、(d)DHS脱水酶(aroZ)、(e)原儿茶酸脱羧酶(aroY)、(f)儿茶酚1,2
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双加氧酶(catA)、(g)10％Pt/C,H2,3400kPa,25℃。附图取自Niu等，Biotechnol.Prog.18:201
‑
211(2002))。
[0014]图6显示使用α
‑
酮戊二酸作为起点经α
‑
酮己二酸合成己二酸的示例性途径。
[0015]图7显示使用赖氨酸作为起点合成己二酸的示例性途径。
[0016]图8显示使用己二酰
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CoA作为起点的示例性己内酰胺合成途径。
[0017]图9显示使用α
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酮己二酸作为起点的示例性己二酸合成途径。
具体实施方式
[0018]本专利技术涉及具有己二酸、6
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氨基己酸或己内酰胺的生物合成性制备能力的细胞和生物体的设计和产生。本文所述的结果表明代谢途径可以被设计和重组改造，从而在大肠杆菌(Escherichia coli)和其他细胞或生物体中实现己二酸、6
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氨基己酸或己内酰胺的生物合成。通过构建具有设计的代谢基因型的菌株可以确认己二酸、6
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氨基己酸和己内酰胺的生物合成性制备。这些代谢改造的细胞或生物体还可以进行适应进化以进一步增加己二酸、6
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氨基己酸或己内酰胺的生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。
[0019]如本文所公开的，描述了许多用于产生己二酸、6
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氨基己酸和己内酰胺的代谢途径。发现两种途径——逆向己二酸降解途径和3
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氧代己二酸途径——在下列方面是有益的：(i)己二酸产率(以葡萄糖计，92％摩尔产率)，(ii)对于己二酸合成不需要氧，(iii)相关的能量学，和(iv)产生作为单一发酵产物的己二酸的理论能力。还描述了通过α
‑
酮己二酸或赖氨酸产生己二酸的代谢途径，但其产率较低，并且需要通气以达到最大产量。本文还公开了用于从己二酰
‑
CoA产生6
‑
氨基己酸或己内酰胺或两者的途径，所述己二酰
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非天然存在的微生物生物体，包括具有己二酸途径的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括α
‑
酮己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α
‑
酮己二酸激酶或α
‑
酮己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱氢酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
‑
CoA还原酶；和己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶或己二酰
‑
CoA水解酶。2.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。3.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。4.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含四种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。5.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含五种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。6.权利要求5所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述五种外源性核酸编码α
‑
酮己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α
‑
酮己二酸激酶或α
‑
酮己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱氢酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
‑
CoA还原酶；和己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶或己二酰
‑
CoA水解酶。7.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述至少一种外源性核酸是异源核酸。8.权利要求1所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述非天然存在的微生物生物体在基本上厌氧的培养基中。9.权利要求1
‑
8任一项所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述非天然存在的微生物生物体是细菌、酵母或真菌的物种。10.权利要求9所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述细菌选自由以下组成的组：大肠杆菌(Escherichia coli)、奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺旋菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄酸杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonoas putida)。11.权利要求9所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述酵母或真菌选自由以下组成的组：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)和毕赤酵
母(Pichia pastoris)。12.一种产生己二酸的方法，包括在产生己二酸的条件下和足以产生己二酸的时间内培养具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括α
‑
酮己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α
‑
酮己二酸激酶或α
‑
酮己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱氢酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
‑
CoA还原酶；和己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶或己二酰
‑
CoA水解酶。13.权利要求12所述的方法，其中所述非天然存在的微生物生物体在基本上厌氧的培养基中。14.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。15.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。16.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含四种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。17.权利要求12所述的方法，其中所述微生物生物体包含五种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。18.权利要求17所述的方法，其中所述五种外源性核酸编码α
‑
酮己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α
‑
酮己二酸激酶或α
‑
酮己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱氢酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
‑
CoA还原酶；和己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶或己二酰
‑
CoA水解酶。19.权利要求12所述的方法，其中所述至少一种外源性核酸是异源核酸。20.权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括将己二酸与培养物中的其他组分分离。21.权利要求20所述的方法，其在所述分离包括萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤。22.权利要求21所述的方法，其中所述萃取是连续液
‑
液萃取。23.一种非天然存在的微生物生物体，包括具有己二酸途径的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括2
‑
羟基己二酸脱氢酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸羟基己二酰转移酶/2
‑
羟基己二酸激酶或2
‑
羟基己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
‑
CoA还原酶；和己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶或己二酰
‑
CoA水解酶。24.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含两种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。25.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含三种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。26.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含四种
各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。27.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体包含五种各自编码己二酸途径酶的外源性核酸。28.权利要求27所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述五种外源性核酸编码2
‑
羟基己二酸脱氢酶；2
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羟基己二酰
‑
CoA合成酶、磷酸羟基己二酰转移酶/2
‑
羟基己二酸激酶或2
‑
羟基己二酰
‑
CoA:乙酰
‑
CoA转移酶；2
‑
羟基己二酰
‑
CoA脱水酶；5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰
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CoA还原酶；和己二酰
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CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰
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CoA:乙酰
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CoA转移酶或己二酰
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CoA水解酶。29.权利要求23所述的非天然存在的微生物生物体，其中所述至少一种外源...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：