一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于基因多态性检测技术领域，具体涉及一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测C667T位点多态性的引物和探针组合，PCR反应液以及样品稀释液。所述样品稀释液具有稀释DNA样本的作用，同时还能降低DNA检出限。本发明专利技术提供的样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺配制得到的水溶液，其中，二甲基亚砜浓度为0.01

【技术实现步骤摘要】
一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒


[0001]本专利技术属于基因多态性检测
，具体涉及一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]叶酸，又称为维生素B9，在DNA合成、DNA甲基化等方面发挥重要作用，是细胞增殖、组织生长与机体发育不可缺少的营养素。由于机体叶酸摄入量不足，或者因为遗传缺陷导致机体对叶酸利用能力低下，均会导致细胞周期不正常，蛋白质甲基化异常，导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人发生癌症或者心血管疾病。经验证，亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10
‑
methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢中的关键酶，催化5,10
‑
亚甲基四氢叶酸还原为5
‑
甲基四氢叶酸，5
‑
甲基四氢叶酸是体内物质合成的间接甲基供体。MTHFR基因一旦发生缺陷，将导致机体多个基础生化过程紊乱，尤其是对于孕妇人群会引起胎儿神经管缺陷。
[0003]MTHFR C667T位点的基因型包括野生型（677CC型）、野生突变杂合型（677CT型）和突变型（677TT型）。C677T位点突变会导致酶对热不耐受使酶的活性降低，与CC型个体相比，CT型个体酶活性只有65%，TT型个体酶活性只有30%。因此，MTHFR C667T位点基因分型检测可提示有突变型等位基因的人群及时补充叶酸，降低由于叶酸不足导致的5
‑
甲基四氢叶酸合成不足的脑卒中等心脑血管病的风险，为个体化增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。
[0004]专利文献202010942972.8公开了一种检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，所述方法针对C677T位点分别设计了野生型和突变型的引物和探针，使用qPCR技术扩增C677T位点的野生型目的片段和突变型目的片段。再如，专利文献202011546979.4公开了一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合，所述方法针对MTHFR基因多态性在其677和1298位点设计特异性引物，并且选用和MTHFR基因在同一条染色体上的RPAP2基因作为内参基因。虽然上述两种方法披露的对MTHFR基因突变的检测准确率均为100%，但是检测方法检测限高。
[0005]对于一些DNA含量较低的样本，如唾液或者尿液等，现有公开的试剂盒由于检出限较高对上述样本无法进行直接检测。为了改善现有技术的缺陷，本专利技术提供一种人MTHFR基因C677T位点多态性检测试剂盒，所述试剂盒检测限低，使以唾液或者尿液作为样本直接进行基因分型检测成为可能。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的是提供一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，本专利技术的另一个目的是提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒及其试剂盒的应用方法。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，其特征在于，包括：如SEQ ID No.1
‑
2所示的MTHFR基因C667T正向扩增引物和MTHFR基
因C667T反向扩增引物，以及如SEQ ID No.3所示的MTHFR基因C667C探针，如SEQ ID No.4所示的MTHFR基因C667T探针。
[0008]优选的，所述用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合还包括：如SEQ ID No.5
‑
6所示的内参正向扩增引物和内参反向扩增引物，以及如SEQ ID No.7所示的内参探针。
[0009]MTHFR基因C667T正向扩增引物5
’‑
CTCAAAGAAAACTGCGTGA
‑3’
MTHFR基因C667T反向扩增引物5
’‑
AGCAGGGAGCTTTGAGGCTG
‑3’
MTHFR基因C667C探针5
’‑ꢀ
TGAAATCGGCTCCCGC
‑3’
MTHFR基因C667T探针5
’‑ꢀ
TGAAATCGACTCCCGC
‑3’
。
[0010]内参正向扩增引物5
’‑
ACCTCTGACCATCCTTCCCA
‑3’
内参反向扩增引物5
’‑
GGAAGTTGTCAAAGATGGTGCC
‑3’
内参探针5
’‑
CATCCTCCAGGTCAAG
‑3’
。
[0011]优选的，上述探针的5
’
端分别标记不同的荧光基团，3
’
端标记MGB。本专利技术对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本专利技术的优选实施方式中，所述探针的5
’
端标记FAM荧光基团、VIC荧光基团或者ROX荧光基团。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如上所示的引物和探针组合，以及PCR反应液。
[0013]优选的，所述引物和探针的浓度为0.1
‑
1μmol/L，所述PCR反应液中MgCl2终浓度为1.5
‑
2.0mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷（dNTPs）混合液终浓度为100
‑
200 nM，热启动DNA聚合酶浓度为1
‑
2U/反应。
[0014]优选的，所述引物的浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L。
[0015]优选的，所述MgCl2终浓度为1.5mM。
[0016]优选的，所述等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷（dNTPs）混合液终浓度为100 nM。
[0017]优选的，所述热启动DNA聚合酶浓度为2U/反应。
[0018]优选的，所述试剂盒中还包括样品稀释液，所述样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺配制得到的水溶液，其中，二甲基亚砜浓度为0.01
‑
0.1mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1
‑
0.3mg/mL。
[0019]更优选的，所述二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1mg/mL。
[0020]所述烷基酰胺为甲酰胺、乙酰胺、烷基酰胺甜菜碱、N、N
‑
双羟乙基烷基酰胺中的一种或两种以上的组合。
[0021]优选的，所述烷基酰胺为烷基酰胺甜菜碱或者N、N
‑
双羟乙基烷基酰胺。
[0022]在本专利技术的优选实施方式中，所述烷基酰胺为N、N
‑
双羟乙基烷基酰胺。
[0023]第三方面，本专利技术提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒的应用方法，所述方法包括如下步骤：（1）DNA提取：从待测样本中提取基因组DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，其特征在于，包括：如SEQ ID No.1
‑
2所示的MTHFR基因C667T正向扩增引物和MTHFR基因C667T反向扩增引物，以及如SEQ ID No.3所示的MTHFR基因C667C探针，如SEQ ID No.4所示的MTHFR基因C667T探针。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，还包括：如SEQ ID No.5
‑
6所示的内参正向扩增引物和内参反向扩增引物，以及如SEQ ID No.7所示的内参探针。3.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5
’
端标记FAM荧光基团、VIC荧光基团或者ROX荧光基团，3
’
端标记MGB。4.一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1
‑
3任一所述的引物和探针组合，以及PCR反应液，所述引物和探针的浓度为0.1
‑
1μmol/L，所述PCR反应液中MgCl2终浓度为1.5
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2.0mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷混合液终浓度为100
‑
200 nM，热启动DNA聚合酶浓度为1
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2U/反应。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L，MgCl2终浓度为1.5mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷混合液终浓度为100 nM，热启动DNA聚合酶浓度为2U/反应。6.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾亚平，赖楚明，
申请(专利权)人：深圳市天大生物医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：