一种抗体耦联药物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗体耦联药物及其应用。所述抗体耦联药物为抗体上耦联有药物海兔毒素，所述抗体包括9G8纳米抗体、7D12纳米抗体和IgG1型抗体的Fc，双链结构的Fc两条链各自融合一分子的9G8纳米抗体和7D12纳米抗体，9G8纳米抗体的氨基酸序列是由如SEQ ID No.1所示序列将第7位和/或第71位丝氨酸突变为半胱氨酸后用于耦联海兔毒素，所述抗体耦联药物的DAR值为1～2。本发明专利技术通过纳米抗体保守位点的定点半胱氨酸突变使融合蛋白可以很容易的连接小分子毒素，偶联产物的均一性良好，且在体内外实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力。相比目前已上市的西妥昔单抗，该融合蛋白偶联物的CDC效应更强，且能克服一系列EGFR胞外区的耐药突变。且能克服一系列EGFR胞外区的耐药突变。且能克服一系列EGFR胞外区的耐药突变。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体耦联药物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，特别是涉及一种抗体耦联药物及其应用。

技术介绍

[0002]抗体偶联药物是一类将抗体和细胞毒性小分子药物相结合的抗体修饰类药物，因结合了抗体的靶向性和化疗药物的杀伤性而受到人们的关注。如果把抗体部分看做靶向的制导系统，那么连接在上面的高效细胞毒性小分子药物就是负责杀伤的载药，理论上可以实现定点杀伤目标的效果。通过将化学小分子偶联在抗体上，可以拓宽小分子药物的治疗窗，减轻其副作用，并且发挥抗体药物的长半衰期以及抗体介导的各类免疫效应。
[0003]表皮生长因子受体(EGFR)是细胞表面酪氨酸激酶受体家族的一类跨膜糖蛋白，起到调节细胞增殖，生长，分化以及迁移的作用。在正常情况下，EGFR的信号通路是受到严格调控的，而在很多癌症中，由于EGFR的异常过量表达，会导致下游信号通路的失调，和一些表皮生长相关肿瘤的发病机理密切相关。目前比较常见的EGFR过表达的癌种有肺癌，结直肠癌以及鳞状细胞癌等，EGFR的异常过表达与很多癌症患者的不良愈后和生存密切相关。
[0004]靶向EGFR的ADC药物在结合肿瘤细胞表面的EGFR后可以通过内吞进入肿瘤细胞来释放细胞毒性小分子发挥杀伤效果，可以有效的克服部分EGFR胞内下游信号的突变，比如KRAS，BRAF突变等。然而，目前临床上发现有部分患者经西妥昔治疗一段时间后会产生如S492R，G465R之类EGFR胞外点突变，直接影响EGFR抗体的亲和力。面对这类耐药性点突变，原本有效的ADC药物也会因为无法有效亲和突变后的肿瘤组织，影响其疗效。
[0005]传统的ADC药物通常选择抗体自身的赖氨酸或者半胱氨酸作为小分子药物的偶联位点。抗体自身的赖氨酸较多，最终得到的偶联产物是偶联多种赖氨酸位点的混合物。。半胱氨酸偶联位点则相对较少，抗体自身暴露在表面可供偶联的半胱氨酸位点只有还原抗体的链间二硫键后才会出现，正常结构的抗体总共有4对链间二硫键，因此，正常结构的抗体最多有8个可供偶联的半胱氨酸位点。常规的非定点偶联方式都会产生异质性较大的偶联产物，最终的反应产物是含不同DAR比值组分的混合。由于各组分的偶联位点是不同的，各组分的体内药代动力学，药效以及安全性均存在不同程度上的差异。
[0006]补体最初被认为是一类参与天然免疫的蛋白，主要在这第一道防线中起到防范细菌入侵，激活炎症因子的释放以及介导溶菌的作用，从而为后续的获得性免疫争取时间。上世纪70年代研究补体和恶性肿瘤的关系时发现在特定的体内外环境中肿瘤细胞可以激活补体，并且后来发现补体杀伤肿瘤细胞的过程和抗体介导的免疫效应密切相关。抗体在结合肿瘤细胞表面后，可以同时使补体蛋白也结合至靶细胞表面，进而通过补体依赖的细胞毒性(CDC)来杀伤肿瘤细胞。目前已上市的抗EGFR抗体药物，如西妥昔和帕尼单抗，帕尼单抗本身是IgG2型抗体，其免疫效应本身就很弱，几乎没有CDC效应，而IgG1型的西妥昔，体内外的CDC效应也较弱。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种针对EGFR的纳米抗体Fc融合蛋白与海兔毒素(Monomethyl auristatin E，MMAE)偶联形成的抗体偶联物及其制备方法和应用。
[0008]一种抗体耦联药物，为抗体上耦联有药物海兔毒素，
[0009]所述抗体包括9G8纳米抗体、7D12纳米抗体和IgG1型抗体的Fc，其中IgG1型抗体的Fc为双链结构，
[0010]9G8纳米抗体和7D12纳米抗体融合后再与IgG1型抗体的Fc融合，且双链结构的Fc两条链各自融合一分子的9G8纳米抗体和7D12纳米抗体，
[0011]9G8纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，
[0012]7D12纳米抗体的氨基酸序列是由如SEQ ID No.3所示序列将第7位和/或第71位丝氨酸突变为半胱氨酸后用于耦联海兔毒素，
[0013]IgG1型抗体的Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，
[0014]所述抗体耦联药物的DAR值为1～2。
[0015]一份子的抗体上，两条链上可以均耦联一分子药物，此时DAR值为2，也可以只有其中一条链上耦联了一分子药物，此时DAR值为1，两种均有效。大部分情况下，在制备时，是两种形式的混合物，可以纯化后获得均一的抗体耦联药物，也可以是两种DAR形式都存在的混合物。
[0016]优选的，9G8纳米抗体的C端与7D12纳米抗体的N端融合，7D12纳米抗体的C端与Fc的N端融合。更优选的，9G8纳米抗体与7D12纳米抗体之间通过柔性连接肽连接，柔性连接肽为(GGGGS)n，其中n为1～3的自然数。进一步优选的，抗体的两条链中，未将其中7D12纳米抗体的第7位和/或第71位丝氨酸突变为半胱氨酸之前的单条链的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。进一步优选的，所述的抗体耦联药物，还将Fc的氨基酸序列第215位由E突变为G(按照Kabat的EU索引来对残基进行编号(Edelman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1969)78
‑
85)，Fc上的第215位对应的是全抗重链中的第430位)。
[0017]本专利技术又提供了所述抗体耦联药物的制备方法，包括一下步骤：
[0018](1)通过重组表达、纯化获得所述抗体，
[0019](2)使用还原剂处理使抗体的链间二硫键打开，再用氧化剂使链间二硫键重新连接，
[0020](3)将mc
‑
vc
‑
MMAE与抗体反应，使马来酰亚胺基团与巯基发生迈克尔加成反应，获得耦联上药物的抗体耦联药物。
[0021]mc
‑
vc
‑
MMAE是由MMAE与vc接头连接而成，全称MC
‑
VC
‑
PAB
‑
MMAE。MMAE首先与vc接头相连接，经纯化制备后，其马来酰亚胺基团再与抗体的链间二硫键发生加成反应制得抗体偶联药物。
[0022]步骤(2)中先用还原剂处理使抗体的链间二硫键打开，再用氧化剂使链间二硫键重新连接，这样做是为了让突变后的半胱氨酸暴露出来，而链间二硫键的半胱氨酸不暴露出来。还原剂一般可以使用TCEP，氧化剂一般可以使用DHAA。
[0023]本专利技术还提供了所述抗体耦联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述抗肿瘤药物针对的肿瘤类型为EGFR阳性的实体瘤。
[0024]本专利技术通过纳米抗体保守位点的定点半胱氨酸突变使融合蛋白可以很容易的连接小分子毒素，偶联产物的均一性良好，且在体内外实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力，可以很容易的扩展至以纳米抗体为基础的其他抗体偶联药物中。相比目前已上市的西妥昔单抗，该融合蛋白偶联物的CDC效应更强，且能克服一系列EGFR胞外区的耐药突变，如S492R和G465R。这一类EGFR胞外区耐药突变位点会使目前上市的西妥昔单抗或帕尼单抗无法有效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体耦联药物，为抗体上耦联有药物海兔毒素，其特征在于，所述抗体包括9G8纳米抗体、7D12纳米抗体和IgG1型抗体的Fc，其中IgG1型抗体的Fc为双链结构，9G8纳米抗体和7D12纳米抗体融合后再与IgG1型抗体的Fc融合，且双链结构的Fc两条链各自融合一分子的9G8纳米抗体和7D12纳米抗体，9G8纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，7D12纳米抗体的氨基酸序列是由如SEQ ID No.3所示序列将第7位和/或第71位丝氨酸突变为半胱氨酸后用于耦联海兔毒素，IgG1型抗体的Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述抗体耦联药物的DAR值为1～2。2.如权利要求1所述的抗体耦联药物，其特征在于，9G8纳米抗体的C端与7D12纳米抗体的N端融合，7D12纳米抗体的C端与Fc的N端融合。3.如权利要求2所述的抗体耦联药物，期特征在于，9G8纳米抗体与7D12纳米抗体之间通过柔性连接肽连接，柔性连接肽为(G...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊建声，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：