非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用技术方案

本发明专利技术涉及非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用。基于现有基因敲除系统的靶基因敲除效率不高，且脱靶位点难以准确定位，本发明专利技术首次将非同源双链寡聚核苷酸片段与基因敲除系统相结合用于基因敲除，非同源双链寡聚核苷酸片段能够激发细胞的非同源末端连接修复，引入更多插入或缺失，同时非同源双链寡聚核苷酸片段可插入切割断点处，可作为标记物监测脱靶位点，有助于增强靶基因的敲除效率的同时准确监测脱靶效应。的同时准确监测脱靶效应。的同时准确监测脱靶效应。

【技术实现步骤摘要】
非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用。

技术介绍

[0002]随着对基因功能研究的深入，临床把抗病毒治疗方向转向个体化基因编辑领域。然而，现有基因敲除系统(CRISPR/Cas核酸酶系统)对靶基因的敲除效率不高，限制CRISPR/Cas核酸酶系统的发展和应用；同时为了检测脱靶效应，需事先假定脱靶位点与靶标位点相似，但是由于许多脱靶突变发生在与目标位点差异很大的地方，因此脱靶断点的数量和位置是很难预测的。如何提高基因敲除系统的靶基因敲除效率并同时监测脱靶效应成为研究的重点。例如利用CRISPR/Cas9靶向敲除HPV18 E7基因，存在编辑效率有待进一步提高，并且脱靶情况不明等问题，限制了其在临床上的进一步转化应用。
[0003]现有技术为了获得更高的编辑效率，通常采用寻找新的核酸酶、或采用筛选靶活性高的sgRNA、或添加外源增效蛋白、或敲入外源基因片段的同源供体、或对sgRNA的改造等。例如专利CN111718418A公布了一种增强基因编辑的融合蛋白；专利CN112601812A公开了在造血干细胞和/或祖细胞基因疗法中使用的促进同源定向DNA修复的试剂；专利CN107532162A公开了利用编辑寡核苷酸修饰细胞内的基因组序列；专利CN109295060A公开了一种用于基因编辑的配对sgRNA及应用，根据靶标基因或靶标基因组位点的特定编辑需求设计多条sgRNA，选择两条特定间距、对应PAM特定位置组合的sgRNA作为配对sgRNA，配对Cas9
‑
sgRNA可以提高基因编辑效率。更换cas9蛋白，例如sacas9，存在切割效率不足、PAM序列要求更严格的局限性；通过同时添加外源性的小分子化合物提高编辑效率，存在化合物不便于同时递送到细胞内的问题；而对sgRNA的改造仅针对特定的靶基因获得较好的编辑效率，普适性不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，非同源双链寡聚核苷酸片段能够增加基因敲除系统对靶基因的切割断点并能够整合到切割断点处，从而增强靶基因的敲除效果并能够准确判定脱靶位点。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术第一方面提供非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，所述非同源双链寡聚核苷酸片段能够提高基因敲除系统对靶基因的切割效率并能够整合到切割断点处。
[0007]具体地，所述非同源双链寡聚核苷酸片段能够激发细胞的非同源末端连接修复，引入更多插入或缺失。
[0008]具体地，通过将用于敲除靶基因的CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段共转染细胞。
[0009]优选地，将所述非同源双链寡聚核苷酸片段还可作为标记物用于监测基因敲除系统的脱靶效应。
[0010]具体地，将用于敲除靶基因的CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段共转染细胞后，采用GUIDE
‑
seq方法分析非同源双链寡聚核苷酸片段的整合位置判定脱靶位点。
[0011]基于现有基因敲除系统的敲除效果不好且脱靶位点难以准确定位的问题，专利技术人发现仅通过筛选出靶活性高的sgRNA，以此sgRNA构建的CRISPR系统的切割效果依旧不够理想，专利技术人偶然发现将非同源双链寡聚核苷酸片段(非同源dsODN)与基因敲除系统相结合后用于基因敲除，非同源双链寡聚核苷酸片段能够激发细胞的非同源末端连接修复，引入更多插入或缺失(Indel)，同时将非同源双链寡聚核苷酸片段插入切割断点处还可以其作为标记物准确定位脱靶位点，在显著增强靶基因的敲除效率的同时监测脱靶效应，可谓一举两得。
[0012]以上应用中，所述CRISPR系统优选为CRISPR/Cas9系统。目前CRISPR/Cas9系统的研究比较全面，但是其靶基因敲除效率较低且依然存在严重的脱靶效应，将非同源双链寡聚核苷酸片段与之结合能够显著提高CRISPR/Cas9系统的敲除效果并准确定位脱靶位点。
[0013]所述非同源双链寡聚核苷酸片段的序列优选如SEQ ID NO.6所示，或与其具有至少80％及以上的同源性的序列，优选具有至少85％及以上的同源性，进一步优选具有至少90％及以上的同源性，更进一步优选具有至少95％及以上的同源性，再进一步优选具有至少98％及以上的同源性。
[0014]进一步优选地，所述非同源双链寡聚核苷酸片段的5
′
端进行磷酸化修饰、5
′
端的三个核苷酸中相连两个核苷酸之间进行硫甙修饰、3
′
的三个核苷酸中相连两个核苷酸之间进行硫甙修饰。
[0015]5′
端进行磷酸化修饰有利于非同源双链寡聚核苷酸片段与切割端点整合；硫甙修饰有利于提高非同源双链寡聚核苷酸片段在细胞内存在时的稳定性而不易被降解。
[0016]本专利技术第二方面提供一种基因敲除系统，其包括CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段。
[0017]优选地，所述CRISPR系统为CRISPR/Cas9系统。
[0018]优选地，用于敲除靶基因的CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段共转染细胞。
[0019]优选地，所述非同源dsODN的序列如SEQ ID NO.6所示，或与其具有至少80％及以上的同源性的序列，优选具有至少85％及以上的同源性，进一步优选具有至少90％及以上的同源性，更进一步优选具有至少95％及以上的同源性，再进一步优选具有至少98％及以上的同源性。
[0020]进一步优选地，所述非同源双链寡聚核苷酸片段的5
′
端进行磷酸化修饰、5
′
端的三个核苷酸中相连两个核苷酸之间进行硫甙修饰、3
′
的三个核苷酸中相连两个核苷酸之间进行硫甙修饰。5
′
端进行磷酸化修饰有利于非同源双链寡聚核苷酸片段与切割端点整合；硫甙修饰有利于提高非同源双链寡聚核苷酸片段插入切割端点后的稳定性。
[0021]优选地，所述基因敲除系统针对人乳头瘤病毒18型E7基因的敲除。
[0022]根据一些具体实施方式，所述的CRISPR系统的sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，或与其具有至少80％及以上的同源性的序列，优选具有至少85％及以上的同源性，进一步
优选具有至少90％及以上的同源性，更进一步优选具有至少95％及以上的同源性，再进一步优选具有至少98％及以上的同源性；
[0023]或者所述的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，或与其具有至少80％及以上的同源性的序列，优选具有至少85％及以上的同源性，进一步优选具有至少90％及以上的同源性，更进一步优选具有至少95％及以上的同源性，再进一步优选具有至少98％及以上的同源性。
[0024]具体地，将能够与人乳头瘤病毒18型E7基因相结合的sgRNA、Cas9克隆表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，所述非同源双链寡聚核苷酸片段能够提高基因敲除系统对靶基因的切割效率并能够整合到切割断点处。2.根据权利要求1所述的非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，其特征在于：所述非同源双链寡聚核苷酸片段能够激发细胞的非同源末端连接修复，引入更多插入或缺失。3.根据权利要求1所述的非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，其特征在于：所述非同源双链寡聚核苷酸片段还可作为标记物用于监测基因敲除系统的脱靶效应。4.根据权利要求1所述的非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，其特征在于：通过将用于敲除靶基因的CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段共转染细胞。5.根据权利要求4所述的非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用，其特征在于：采用GUIDE
‑
seq方法分析非同源双链寡聚核苷酸片段的整合位置判定脱靶位点。6.一种基因敲除系统，其特征在于：其包括CRISPR系统和非同源双链寡聚核苷酸片段。7.根据权利要求1至5中任一项所述的非同源双...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红娴，兰凯，黄龙，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：