一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型。其制备方法为：1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。本发明专利技术使用对疾病具有治疗作用的间充质干细胞为模型，以编码间充质干细胞分泌的可溶性因子的KGF基因的启动子为靶点，筛选促进间充质干细胞分泌可溶性因子KGF的潜在药物，为使用药物与间充质干细胞联合治疗急性肺损伤，增强疗效，奠定了基础。奠定了基础。奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型


[0001]本专利技术涉及用于潜在药物筛选的细胞模型和潜在药物的筛选方法，具体涉及一种靶向KGF启动子的间充质干细胞治疗急性肺损伤筛选模型。

技术介绍

[0002]急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一种危及生命的疾病并且在患者中死亡率极高。ALI 和ADRS的特征主要是肺泡-毛细血管膜屏障损伤，白细胞积聚，肺水肿，炎症细胞渗出以及肺泡出血，从而导致免疫系统和肺泡毛细血管之间产生复杂关系，导致急性促炎反应。
[0003]间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新，分化能力的细胞。越来越多的研究发现，MSCs可以分泌可溶性因子，如生长因子、抗炎性因子和抗微生物肽等，从而可以稳定肺部微血管屏障，增强肺泡液体的清除，并可以降低感染。并且MSCs来源广泛，可以从多种组织中分离，如骨髓，脂肪，胎盘等。根据临床前的研究，不同来源的MSCs有着不同的免疫和生物功能。人胎盘绒毛膜来源的MSCs（human chorionic villus-derived mesenchymal stem cells，hCMSCs）属于胎盘来源的MSCs，被认为是MSCs的替代来源。由于hCMSCs可以分化成三个胚层并且容易获得，因此与其他来源的MSCs相比具有更好的免疫调节功能。
[0004]角质细胞形成因子（Keratinocyte Growth Factor，KGF）是成纤维细胞生长因子家族成员之一。KGF被认为是MSCs最重要的旁分泌可溶性因子之一，可以在体内和体外刺激II型肺上皮细胞的增殖，促进II型上皮细胞的修复，从而增强机体对肺损伤的抵抗。KGF可以通过促进表面活性物质合成，改善水肿清除率。另有研究发现，KGF可以减少肺损伤时肺内羟基脯氨酸积聚，抑制胶原mRNA的表达，从而阻止肺纤维化。
[0005]高通量药物筛选技术已经成为目前药物筛选领域研究的重要课题，针对靶标的药物研究过程是发现先导化合物的关键，在药物研发过程中起到重要作用。中国专利CN110452880A公开了一种急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用，具体公开了1）将A549细胞置于诱导培养基中进行诱导培养，然后弃去培养基，消化收获细胞；2)将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中，添加炎性物质刺激激发炎症反应，继续培养12-48小时后，即可用于急性肺损伤的药物筛选。而目前未见如本申请所述的用于急性肺损伤药物筛选的细胞模型。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术中的不足，提供了一种用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞、其制备方法和用途，以及一种筛选治疗急性肺损伤潜在药物的方法。
[0007]在第一方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其制备方法为：1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。
[0008]较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体中插入的KGF基因启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建方法为：将KGF基因启动子序列插入到含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc的PacI 和 BamHI位点之间。
[0010]较佳地，所述间充质干细胞是人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞。
[0011]在第二方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。
[0012]较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体中插入的KGF基因启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]较佳地，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建方法为：将KGF基因启动子序列插入到含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc的PacI 和 BamHI位点之间。
[0014]较佳地，所述间充质干细胞是人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞。
[0015]在第三方面，所提供的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞的用途，是用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物。
[0016]在第四方面，所提供的筛选治疗急性肺损伤潜在药物的方法，是使用待试物质刺激所述的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，作用一段时间后，利用并根据荧光素酶报告基因检测荧光强度，来反映KGF基因启动子的活性，从而获得靶向KGF基因启动子促荧光素酶报告基因高效表达的化合物，即得治疗急性肺损伤的潜在药物。
[0017]本专利技术相比于现有技术，其有益效果在于：1、本专利技术药物筛选模型的建立方法不同于以往，以往通常是以293 T 等细胞为基础导入靶标基因，或直接以疾病的代表性细胞为模型。而本专利技术首次使用对疾病具有治疗作用的间充质干细胞为模型，以编码间充质干细胞分泌的可溶性因子的KGF基因的启动子为靶点，筛选促进间充质干细胞分泌可溶性因子KGF的潜在药物，为使用药物与间充质干细胞联合治疗急性肺损伤，增强疗效，奠定了基础。本专利技术的模型可以从海量化合物库中高通量的筛查出具有靶向KGF启动子的化合物，对急性肺损伤疾病治疗药物筛选有良好的应用前景。
[0018]2、利拉鲁肽是GLP-1的类似物，在我们之前的研究中发现，利拉鲁肽具有抑制炎症，促进间充质干细胞KGF-2，Ang-1及SPC表达，从而减轻急性肺损伤的作用。地塞米松是临床上常用的一种糖皮质激素类药物用于治疗ALI早期炎症放大反应，并取得一定的效果，并
且之前有研究发现地塞米松也可以促进KGF的表达。本专利技术应用利拉鲁肽和地塞米松作为药物来验证筛选平台，结果表明该药物筛选平台可筛选出引起KGF表达增高的药物。这表明本专利技术制备的间充质干细胞筛选模型为药物与KGF启动子的作用提供了良好环境，且本专利技术所选择的KGF基因启动子片段以及所构建的质粒载体是合适的，能够与引起KGF表达增高的药物有效结合，避免漏筛。
附图说明
[0019]图1：CV-123-KGF-promoter-Luc重组质粒的构建。
[0020]图2：利拉鲁肽靶向KGF启动子对荧光素酶报告基因的表达强度作用图。
[0021]图3：地塞米松靶向KGF启动子对荧光素酶报告基因的表达强度作用图。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其特征在于，其制备方法为：1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；2）利用步骤1）所述的含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体，制备含有KGF基因启动子的慢病毒溶液，并进一步感染间充质干细胞，筛选稳转株。2.根据权利要求1所述的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其特征在于，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体中插入的KGF基因启动子的序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求1所述的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其特征在于，所述含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建方法为：将KGF基因启动子序列插入到含有荧光素酶报告基因的载体CV123-Luc的PacI 和 BamHI位点之间。4.根据权利要求1所述的用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞是人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞。5.一种用于筛选治疗急性肺损伤潜在药物的靶向KGF启动子的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建含有KGF基因启动子的荧光素酶报告基因载体；2）利用步骤1）所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿介明，冯耘，杨晓彤，陈虹，丁永杰，陈巍，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：