一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。本发明专利技术提供了一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶。所述的如式I所示的共羧化酶。所述的如式I所示的共羧化酶。

【技术实现步骤摘要】
一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。

技术介绍

[0002]共羧化酶(Cocarboxylase，也称为辅羧酶、硫胺焦磷酸酯或二磷酸酯)是维生素B1焦磷酸酯的内盐，其通常还以四水合物(Cocarboxylase Tetrahydrate，又称四水合辅羧酶或四水合硫胺焦磷酸酯)或盐酸盐(又称焦磷酸硫胺素或氯化维生素B1焦磷酸酯)的形式存在。
[0003]共羧化酶同样可与特定的蛋白质一起形成几种酶，它们催化人类和动物有机体代谢中的许多重要反应。
[0004][0005]已有文献报道焦磷酸硫胺素的制备方法较多。1937年，Stern和Hofer利用维生素Bl和三氯氧磷反应制备了焦磷酸硫胺素[cf.Science,Vol.85,p.483(1937)]。J.Weijlard和H.Tauber利用维生素B1和焦磷酸钠与磷酸的混合液制备了焦磷酸硫胺素，通过利用磷酸钙溶液与大量的有机溶剂处理得到硫胺焦磷酸酯，收率在10％左右[cf.Joural of the American Chemical Society,Vol.60,p.2263(1938)]。1940年，文献报道VB1类似物5-溴化乙烯噻唑和磷酸银反应制备氯化VB1焦磷酸酯，以银盐的形式析出，用硫化氢除去银离子,然后用氯化氢处理得到氯化硫胺焦磷酸酯[cf.Biochemical Journal,Vol.34,p.980(1940)]，上述方法需要用到有毒试剂或者大量的有机溶剂，或者温度较高，不利于环境保护。
[0006]US5047223、US2991284、CN1887891A、CN101787048B公开了维生素B1为原料，和磷酸化试剂(例如五氧化二磷与磷酸反应产生的焦磷酸)发生磷酸化反应，先经弱碱性阴离子柱(主要吸附住副产物维生素B1三磷酸酯、维生素B1四磷酸酯等高级磷酸酯，以及磷酸)，浓缩，后经弱酸性阳离子交换树脂纯水洗脱(在水淋洗时牢牢吸附住维生素B1磷酸酶，而辅羧酶却可以毫无保留的洗出，当该树脂柱用10％盐酸淋洗时，又可以将维生素B1磷酸酯完全洗出)，35℃下浓缩，加乙醇析晶可得到产物(最终产物纯度达到99％)，离子柱预处理以及再生过程十分繁琐，2次离子柱，2次35℃下浓缩水所用时长较大。
[0007]JP03145495提到产物的分离和提纯，将所得的磷酸混合物过强碱性阴离子柱离子交换树脂，纯水中加入醋酸(或甲酸、丙酸)洗涤，pH<5.5洗脱液用乙醇析晶，为焦磷酸盐，pH＞5.5洗脱液用丙酮析晶为单磷酸盐，纯度最高为96％。
[0008]US2991284的实施例2中提到将2kg盐酸硫胺素磷酸化所得的磷酸盐混合物先过强碱性离子交换树脂(permutit ES)在pH 6.6-6.0时，得到单磷酸盐；pH在6.0-5.4下，得到单
磷酸盐和焦磷酸盐的混合物，其中单磷酸盐占25％-30％；当pH为5.4-2，得到纯的羧化酶四水合物，该过程中得到纯的焦磷酸酯含量极低，约3％，硫胺磷酸酯和二磷酸酯的分离度较差。

技术实现思路

[0009]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的共羧化酶的纯化方法繁琐、效果差的缺陷，而提供了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。采用本专利技术的纯化方法可经一步离子交换得到高纯度(99％以上)的共羧化酶，并可进一步直接制备得到高纯度的四水合物或焦磷酸硫胺素。
[0010]本专利技术是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。
[0011]本专利技术提供了一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶(硫胺素二磷酸酯)；
[0012][0013]所述的弱碱性阴离子交换树脂可为本领域该类制备方法中常规的弱碱性阴离子交换树脂，例如大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为下列型号之一：D315、D301、D335、D345；本专利技术中较佳地为D301。
[0014]所述的水可为本领域该类制备方法中常规的水，例如纯水。
[0015]所述的pH＝10-12弱碱性水溶液可采用本领域常规的碱调节得到；本专利技术中较佳地为使用氨水调节得到。
[0016]在本专利技术的某一方案中，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中还可含有硫胺素、硫胺素三磷酸酯和高级磷酸酯中的一种或多种。
[0017]在本专利技术的某一方案中，所述的经水洗脱可为本领域该类反应中常规的操作方法，例如洗脱至洗出液中硫胺素一磷酸酯(磷酸单酯)含量低于百分之一(液相监控，具体条件可如实施例中所示)即可。
[0018]在本专利技术的某一方案中，所述的收集洗出液为收集如式I所示的共羧化酶纯度大于95％洗出液(液相监控，具体条件可如实施例中所示)。
[0019]本专利技术中，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物可采用本领域中共羧化酶的常规制备方法得到，例如参考现有技术：
①
Science,Vol.85,p.483(1937)；
②
Joural of the American Chemical Society,Vol.60,p.2263(1938)；
③
Biochemical Journal,Vol.34,p.980(1940)；
④
US5047223；
⑤
US2991284；
⑥
CN1887891A；
⑦
CN101787048B；或
⑧
JP03145495中的方法，或者进行常规条件和操作的选择制备得到含共羧化酶的混合物。本专利技术中特别优选如下步骤制备得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物：
[0020]步骤(1)，将水和醇类溶剂依次加入到维生素B1与磷酸化剂进行磷酸化反应后的反应液中进行混合、静置后的上清液除去，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物的粗品；
[0021]步骤(2)，将上述的粗品和水形成的溶液，使用水不溶性叔胺、或水不溶性叔胺与有机溶剂的混合溶剂进行洗涤，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物即可。
[0022]步骤(1)中，所述的磷酸化剂可为本领域该类磷酸化反应中常规的磷酸化剂，例如焦磷酸，焦磷酸与五氧化二磷或三氯氧磷的混合物，磷酸与五氧化二磷进行反应制备得到的含焦磷酸的混合物，和高浓度磷酸(例如含25％及以上的焦磷酸)中的一种或多种；本专利技术中较佳地为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物(例如磷酸与五氧化二磷的摩尔比为2:1-1:1，又例如1.2:1-1.3:1)。
[0023]所述的磷酸化剂与所述的维生素B1的摩尔比可为本领域该类法中常规的摩尔比；当所述的磷酸化剂为磷酸与五本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶；2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的弱碱性阴离子交换树脂为大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂；和/或，所述的水为纯水；和/或，所述的pH＝10-12弱碱性水溶液为使用氨水调节得到；和/或，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中还含有硫胺素、硫胺素三磷酸酯和高级磷酸酯中的一种或多种；和/或，所述的经水洗脱为洗脱至洗出液中硫胺素一磷酸酯含量低于百分之一即可。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的弱碱性阴离子交换树脂为下列型号之一：D315、D301、D335或D345；和/或，所述的收集洗出液为收集如式I所示的共羧化酶纯度大于95％洗出液。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物采用如下步骤制备得到：步骤(1)，将水和醇类溶剂依次加入到维生素B1与磷酸化剂进行磷酸化反应后的反应液中进行混合、静置后的上清液除去，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物的粗品；步骤(2)，将上述的粗品和水形成的溶液，使用水不溶性叔胺、或水不溶性叔胺与有机溶剂的混合溶剂进行洗涤，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物即可。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的磷酸化剂为焦磷酸，焦磷酸与五氧化二磷或三氯氧磷的混合物，磷酸与五氧化二磷进行反应制备得到的含焦磷酸的混合物，和高浓度磷酸中的一种或多种；和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂为异丙醇和/或乙醇；和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂与所述的维生素B1的体积质量比为2:1-5:1；和/或，步骤(1)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为2:1-5:1；和/或，所述的磷酸化反应的温度为100℃-170℃；和/或，步骤(2)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为1:1-3:1；和/或，步骤(2)中，所述的水不溶性叔胺为12至36个碳原子的：脂族叔胺、脂族-环脂族叔胺和脂族-芳脂族叔胺中的一种或多种；步骤(2)中，所述的有机溶剂为具有4至8个碳原子的醇类溶剂、具有4至8个碳原子的醚类溶剂、具有5至8个碳原子的酮类溶剂和芳烃类溶剂中的一种或多种；步骤(2)中，基于所述的混合溶剂的所述的水不溶性叔胺质量百分比含量为10％至80％。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，磷酸与五氧化二磷的摩尔比为2:1-1:1；例如1.2:1-1.3:1；和/或，步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，五氧化二磷与所述的维生素B1的摩尔比为4:1-2:1；例如3:1-3.5:1；和/或，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，所述的混合物为磷酸与五氧化二磷在100℃-180℃进行反应制备得到；较佳地为150℃-160℃；和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂与所述的维生素B1的体积质量比为3:1-4:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈梦婷，田文军，郭晔堃，
申请(专利权)人：中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：