一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组和试剂盒，涉及生物检测技术领域。本发明专利技术所述引物组包括ECP

【技术实现步骤摘要】
一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组和试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组和试剂盒。

技术介绍

[0002]嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)是嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)活化后释放出的强碱性颗粒蛋白，存在于EOS颗粒的基质部分，占颗粒的30％。ECP是EOS激活后的特异性标志物，可以反映EOS的活化程度，其本身亦具有极强的细胞毒性作用。ECP可在人体大多数体液中发现，如血清、鼻腔分泌物、支气管冲洗液、唾液、泪液等。
[0003]对于嗜酸性粒细胞浸润相关的炎症疾病，EOS脱颗粒蛋白的含量多少比EOS浸润总数更重要。EOS颗粒蛋白主要有：ECP、EOS主要碱性蛋白(major basic protein，MBP)、EOS过氧化物酶(eosinophil peroxidase，EPO)及EOS神经毒素(eosinophil
‑
derived neurotoxin，EDN)，其中ECP的毒性作用尤其显著。在炎症过程中，EOS被活化，发生脱颗粒，导致粘膜损伤，进而增加组织的过敏性，引起慢性炎症，释放ECP，同时引起外周血及膜粘液中ECP水平上升。
[0004]ECP是一种非常重要的气道活性物质，具有收缩支气管平滑肌、破坏肺泡表面活性物质、裂解细胞膜、活化炎性细胞等多种气道效应，参与哮喘的气道高反应性、气道上皮损伤等病理生理过程。哮喘患者嗜酸细胞性炎症导致血液和其它体液如支气管肺泡液和痰液的ECP水平升高，ECP水平客观反映了哮喘患者的嗜酸细胞验证程度，高水平提示哮喘患者的炎症状态。ECP测定可用于监测哮喘炎症，指导哮喘的激素治疗，以及发现对治疗不依从的患者。同时ECP也可用作过敏反应的生化标志物，过敏人群接触或吸入或摄入过敏原后，会引发过敏性哮喘、过敏性皮炎等，也使过敏患者的ECP水平升高。在免疫治疗和回避研究中，ECP都是回避和治疗是否成功或有效的一个有效标志物。
[0005]现在市场上对于ECP的检测仍处于使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测其在体液中的含量，尚未见检测ECP mRNA的商业化试剂盒。ELISA方法在检测过程中存在着检测范围小和灵敏度低的问题，且其准确性也存在问题，所以建立一种准确度高、检测范围广及灵敏度高的方法来检测ECPmRNA表达量是非常必要的。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组和试剂盒，可一步法定量检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)mRNA的表达水平，为该该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组，所述引物组包括ECP
‑
F、ECP
‑
R、GAPDH
‑
F和GAPDH
‑
R；
[0009]所述ECP
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述ECP
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GAPDH
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GAPDH
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]优选的，所述引物组还包括探针E
‑
Probe和探针G
‑
Probe；
[0011]所述探针E
‑
Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述探针G
‑
Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0012]优选的，所述探针E
‑
Probe和探针G
‑
Probe的5
’
端均连接有荧光基团，3
’
端均连接有淬灭基团。
[0013]优选的，所述探针E
‑
Probe和探针G
‑
Probe的5
’
端连接不同的荧光基团，3
’
端连接相同的淬灭基团。
[0014]本专利技术还提供了一种一步法检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
[0015]优选的，所述试剂盒中还包括PCR反应液、酶混合液、ROX参比染料和无核酶水；
[0016]所述酶混合液中的酶包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体；所述Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体的质量比为13:5:3:1。
[0017]优选的，所述PCR反应液包括dNTP mix、MgCl2和缓冲液。
[0018]优选的，所述试剂盒中还包括人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA标准品。
[0019]本专利技术提供了一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)mRNA表达的引物组，并利用所述引物组构建了一步法检测试剂盒。利用所述引物组或所述试剂盒进行一步法检测ECP mRNA的表达水平时，与免疫学检测方法相比，检测的灵敏度更高，可以检测低浓度的临床样本，能够更灵敏地探测到ECP的含量变化，检测范围可跨越至少6个数量级，增加了检测结果的准确性，能在1小时之内完成至少80人份检测，从而更早期、更准确、更快速地对治疗效果进行动态监测和疗效评估。利用本专利技术所述引物组或试剂盒，检测患者ECP mRNA水平变化，可以用于监测哮喘等过敏性疾病或嗜酸性粒细胞浸润类炎症，指导糖皮质激素治疗方案，发现不依从的患者。
附图说明
[0020]图1为ECP mRNATaqMan实时荧光定量RT
‑
PCR标准曲线；
[0021]图2为精密度检测结果图，其中1：1.0
×
106copies/μl，2：1.0
×
103copies/μl；
[0022]图3为准确度检测结果图；
[0023]图4为灵敏度检测结果图；
[0024]图5为临床样本检测结果图，其中1：阳性样本4GAPDH mRNA；2：健康对照2GAPDH mRNA；3：阳性样本4ECP mRNA；4：健康对照2ECP mRNA；5：空白对照NTC
‑
GAPDH mRNA；6：空白对照NTC
‑
ECP mRNA；
[0025]图6为在非最佳引物、探针设计的情况下，低值精密度扩增曲线图；
[0026]图7为酶混合液对扩增曲线的影响；
[0027]图8为pGM
‑
T载体的质粒结构。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一组检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组检测人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白mRNA表达的引物组，其特征在于，所述引物组包括ECP
‑
F、ECP
‑
R、GAPDH
‑
F和GAPDH
‑
R；所述ECP
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述ECP
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GAPDH
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GAPDH
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述引物组还包括探针E
‑
Probe和探针G
‑
Probe；所述探针E
‑
Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述探针G
‑
Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求2所述引物组，其特征在于，所述探针E
‑
P...

【专利技术属性】
技术研发人员：程雷，沈华浩，吴善东，刘奕，吴周杰，蒋学翰，王教峰，王溢飞，
申请(专利权)人：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：