一种人白三烯受体CysLTR1mRNART-PCR检测用引物探针组和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT

【技术实现步骤摘要】
一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用引物探针组和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
‑
PCR检测用引物探针组和试剂盒。

技术介绍

[0002]白三烯是从花生四烯酸在白细胞中代谢产物分离得到的具有共轭三烯结构的二十碳不饱和酸。可由花生四烯酸经脂(肪)氧合酶(lipoxygenase)催化而制得。在体内含量虽然很低，但却具有很高的生理活性，是引发某些过敏反应、炎症以及心血管等疾病的化学介质。白三烯在上下呼吸道的炎症中起重要作用。在诱导鼻过敏反应方面，白三烯的作用比组织胺强1000多倍。在变应原诱导的鼻过敏反应中，无论是在速发反应还是迟发反应阶段，白三烯的数量都显着增加。半胱氨酰白三烯(Cysteonyl leukotrienes，CysLTs)是哮喘和过敏性鼻炎(AR)的病理生理中的炎症介质和调节因子，是关键的治疗靶点，CysLTs可以调节造血祖细胞生成、嗜酸性粒细胞在炎症组织募集和存活、细胞因子和趋化因子的活性、呼出气NO的数量、平滑肌的收缩和成纤维细胞的增殖。
[0003]CysLTs的生物学作用取决于细胞表面白三烯受体的表达。CysLTs受体有CysLTR1和CysLTR2两种，其中CysLTR1为G蛋白偶联受体，主要表达于脾、肺、平滑肌等。CysLTR1被白三烯激活后，介导持续的平滑肌细胞收缩及增生、黏膜水肿、嗜酸性细胞聚集、黏液分泌增多，从而直接导致哮喘气道炎症的发生与发展，在哮喘的发病机制中起主要作用。已被批准的CysLT1受体拮抗剂(如孟鲁司特、扎鲁司特和普鲁司特)作用于CysLTR1，用于阻断CysLT1的致哮喘作用。在治疗的过程中，白三烯受体拮抗剂(LTRA)可以在体内竞争性抑制白三烯与其受体的结合，阻断CysLTs的活性，从而抑制炎性、过敏性反应，但其疗效具有明显的个体差异，并且其疗效与白三烯受体基因mRNA表达水平有明确的正相关。通过对CysLTR1mRNA表达水平的检测，可判断出LTRA是否达到阻断CysLTR1的活性的效果，这对药物治疗CysLTR1通路引起的过敏反应及炎症反应是否有效具有一定的治疗意义。
[0004]现在市场上对于CysLTR1的检测仍使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测其在体液中的含量，尚未见检测CysLTR1 mRNA的商业化试剂盒。ELISA方法在检测过程中存在着检测范围小和灵敏度低的问题，且其准确性也存在问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用引物探针组和试剂盒。本专利技术针对人CysLTR1建立的TaqMan实时荧光定量一步法RT
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PCR检测引物探针组，为该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。
[0006]本专利技术提供了一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括引物CysLTR1
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F、引物CysLTR1
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R和探针C1
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Probe，所述引物CysLTR1
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F的核
苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物CysLTR1
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针C1
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Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]优选的是，所述探针C1
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Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。
[0008]优选的是，还包括内参基因的引物GAPDH
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F、引物GAPDH
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R，和探针G
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Probe，所述引物GAPDH
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物GAPDH
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述探针G
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Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0009]优选的是，所述探针G
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Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团；探针G
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Probe标记的荧光报告基团与探针C1
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Probe标记的荧光报告基团不同。
[0010]优选的是，所述荧光报告基团包括FAM和JOE，所述淬灭基团包括BHQ1。
[0011]本专利技术还提供了一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组、PCR反应液、酶混合液、CysLTR1标准品、ROX参比染料和无核酶水。
[0012]优选的是，所述PCR反应液包括dNTPmix、MgCl2和缓冲液。
[0013]优选的是，所述酶混合液包括Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶抗体。
[0014]本专利技术还提供了上述技术方案所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将引物探针组、PCR反应液、酶混合液、标准品或待测样品、ROX参比染料和无核酶水混合后，进行荧光定量扩增。
[0015]优选的是，以20μL计，所述试剂盒的反应体系包括：引物探针组2μL、PCR反应液10μL、酶混合液0.5μL、ROX参比染料0.1μL、标准品或待测样品5μL和无核酶水2.4μL；
[0016]所述荧光定量扩增的条件为：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，扩增40个循环。
[0017]本专利技术提供了一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用引物探针组。本专利技术所述引物探针组用于检测时，采用一步法检测，无需单独进行反转录操作，极大降低了造成气溶胶污染的风险；与免疫学检测方法相比，利用本专利技术引物探针组的检测方法检测的灵敏度高，可以检测低浓度(10copies/μL)的临床样本，能够更灵敏地探测到CysLTR1的含量变化，检测范围可跨越至少5个数量级，增加了检测结果的准确性，能更早期、更准确、更快速地对治疗效果进行动态监测和疗效评估。
附图说明
[0018]图1为本专利技术提供的稀释操作过程图；
[0019]图2为本专利技术提供的CysLTR1 mRNATaqMan实时荧光定量RT
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PCR标准曲线；
[0020]图3为本专利技术提供的精密度检测结果图；其中1：1.0
×
107copies/μL，2：1.0
×
104copies/μL；
[0021]图4为本专利技术提供的准确度检测结果图；
[0022]图5为本专利技术提供的灵敏度检测结果图；
[0023]图6为本专利技术提供的临本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人白三烯受体CysLTR1 mRNA RT
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PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括引物CysLTR1
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F、引物CysLTR1
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R和探针C1
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Probe，所述引物CysLTR1
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物CysLTR1
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针C1
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Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针C1
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Probe的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，还包括内参基因的引物GAPDH
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F、引物GAPDH
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R和探针G
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Probe，所述引物GAPDH
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述引物GAPDH
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述探针G
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Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述探针G

【专利技术属性】
技术研发人员：刘奕，吴周杰，吴善东，蒋学翰，王教峰，雷薇，钱磊，
申请(专利权)人：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：