一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA引物、试剂盒和检测方法，涉及病毒检测技术领域。本发明专利技术提供一种新的用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：正向引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；探针为SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。利用该组合物可以基于重组酶聚合酶扩增技术，高效快速地检测样品中是否含有绵羊肺腺瘤病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。本发明专利技术还提供一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒及利用本发明专利技术的荧光RPA组合物检测绵羊肺腺瘤病毒的方法。物检测绵羊肺腺瘤病毒的方法。物检测绵羊肺腺瘤病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA引物、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
更具体地，涉及一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA引物、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]绵羊肺腺瘤病(Ovine Pulmonary Adenocarcinoma，OPA)是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(Exogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus，exJSRV)引起的一种慢性、接触性、传染性、肺肿瘤性疾病。是以患羊咳嗽、呼吸困难、消瘦、大量浆液性鼻漏、Ⅱ型肺泡上皮细胞和细支气管上皮细胞肿瘤性增生为主要特征的疾病。OPA病例已在世界多个国家地区的不同品种羊中被鉴定。由于疾病临床特征不明显，潜伏期长，感染不易被发现，疫病大规模扩散，并存在垂直传播。患本病的肉羊大规模进行性消瘦并最终死亡，患病种羊配种率低最终淘汰。世界上第一只克隆羊Dolly也死于本病。因此，OPA被作为一种重要的经济和动物福利问题被广泛关注。由于绵羊肺腺瘤病主要感染多品种和不同年龄的绵羊，特别是昂贵的种羊更易感。羊只一旦感染该病毒，其病死率为100％。因而OPA的持续存在已严重威胁种羊的生产和养羊业的发展，同时威胁到羊肉的食品安全，造成较大的经济损失。
[0003]目前还没有建立适合JSRV繁殖的体外培养环境，故无法采用现有的病毒鉴定分离方法对其进行诊断。同时enJSRVEnv(内源性绵羊肺腺瘤病毒)在绵羊体内大量表达，绵羊对exJSRV形成免疫耐受从而在其体内检测不到特异性抗体，所以也不能用血清学试验对OPA进行诊断。目前实验室针对exJSRV的诊断主要为PCR、斑点杂交技术、ELISA、LAMP等检测方法。但是，PCR检测技术操作复杂、需要专业的技术人员并且需要1～2h才能看到检测结果，无法在基层推广，不能实现病原体的现场快速检测；斑点杂交技术虽然可以用于临床诊断，但2～3d才能检测出结果，并且在检测过程中要求变换反应温度，操作也比较复杂；ELISA成本较高，操作复杂，不适合养殖场的大规模检测；LAMP的检测过程需要6条引物的参与才能完成，故该方法的引物设计相当复杂，而且由于判定结果时需要将试管打开，容易有假阳性的结果出现。
[0004]因此，需开发出一种快速、灵敏度高、特异性强的绵羊肺腺瘤病毒检测试剂盒，实现对绵羊肺腺瘤病毒的快速检测，完成实验室之外的现场诊断。

技术实现思路

[0005]基于上述问题，本专利技术的第一个目的在于提供一组用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA组合物，利用该组合物可以基于重组酶聚合酶扩增技术，高效快速地检测样品中是否含有绵羊肺腺瘤病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种利用本专利技术的荧光RPA组合物检测绵羊肺腺瘤病毒的方法。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]本专利技术提供一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：
[0010]正向引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
[0011]反向引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
[0012]探针为SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。
[0013]优选地，所述探针在距离5
’
端的第31个碱基“A”用THF替代，在THF位点上游的T碱基标记FAM荧光基团，在THF位点下游的T碱基标记BHQ1荧光基团，并在3
’
末端标记C3 Spacer。
[0014]本专利技术还提供一种如上所述的荧光RPA组合物在制备用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒中的应用。
[0015]根据本专利技术的第二个目的，本专利技术还提供用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的荧光RPA组合物。
[0016]优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0017]优选地，所述阳性对照为绵羊肺腺瘤病毒env基因的体外反转录cDNA。
[0018]优选地，所述试剂盒还包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
[0019]根据本专利技术的第三个目的，本专利技术还提供一种绵羊肺腺瘤病毒的检测方法，所述检测方法包括：
[0020]提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA；
[0021]配制荧光RPA反应体系，所述反应体系包括如权利要求1或2所述的荧光RPA组合物；
[0022]以反转录获得的cDNA为模板，进行荧光RPA扩增反应；
[0023]结果判定。
[0024]优选地，所述荧光RPA反应体系，以总体积50μL计，包括10μM的正向引物2.1μL，10μM的反向引物2.1μL，10μM的探针0.6μL。
[0025]优选地，所述荧光RPA扩增反应的反应温度为40℃，反应时间为20min。
[0026]本专利技术的有益效果如下：
[0027]本专利技术提供的荧光RPA组合物以及利用该荧光RPA组合物检测绵羊肺腺瘤病毒的方法，是根据exJSRV保守的env基因设计引物和探针，env基因可编码Env，Env在OPA中起主要的致癌作用。在40℃恒温条件下，从反应10min中左右开始即可观察到扩增曲线，10～20min内成指数扩增。与PPRV、OSS、BEV、IBRV、BPIV3、MO等病原核酸无交叉反应；与PCR检测方法的灵敏度相同；稳定性良好；可有效检测出病羊肺组织、鼻液及外周血白细胞内的exJSRV，并能准确的区分出enJSRV与exJSRV的核酸序列。本专利技术建立的绵羊肺腺瘤病毒荧光RPA检测方法，最低检测限可以达到1ng/μL，可在绵羊感染JSRV早期进行现场快速诊断，对OPA的快速识别和传播控制具有重要意义。
附图说明
[0028]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0029]图1示出JSRV鉴定结果，其中，M：标准分子量DL2000；1、2：JSRV病肺；3：阴性对照。
[0030]图2示出荧光RPA引物筛选结果，其中，1：F1/R1；2：F2/R2；3：F3/R3；4：F4/R4。
[0031]图3示出最佳反应温度筛选。
[0032]图4示出荧光RPA特异性检测，其中，1:JSRV；2:PPRV；3:OSS；4:BEV；5:IBRV；6:BPIV3；7:MO；8:阴性对照。。
[0033]图5示出病肺cDNA为模板的荧光RPA的灵敏度试验，其中，1～7：cDNA的稀释度分别为1000ng/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL；8：阴性对照。
[0034]图6示出病肺cDNA为模板的荧光RPA重复性试验，其中，1～3：100ng/μL浓度；4～6：10ng/μL浓度；7：阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA组合物，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：正向引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；反向引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；探针为SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的荧光RPA组合物，其特征在于，所述探针在距离5
’
端的第31个碱基“A”用THF替代，在THF位点上游的T碱基标记FAM荧光基团，在THF位点下游的T碱基标记BHQ1荧光基团，并在3
’
末端标记C3 Spacer。3.一种如权利要求1或2所述的荧光RPA组合物在制备用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒中的应用。4.一种用于检测绵羊肺腺瘤病毒的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的荧光RPA组合物。5.根据权利要求4所述的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑英，齐景伟，李慧萍，张良，安晓萍，张琳，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：