一种利用水稻胚乳细胞特异表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种利用水稻胚乳细胞特异表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体及其应用。本发明专利技术提供一种启动表达新冠病毒刺突蛋白的重组启动子，所述重组启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发利用水稻的胚乳细胞的蛋白体作为重组蛋白的贮存点，通过水稻胚乳特异性表达的重组启动子，介导重组新冠病毒刺突蛋白进入胚乳细胞的内膜系统并储存至胚乳细胞的蛋白体中，从而达到大量生产的目的，表达稳定，且制备的新冠病毒刺突蛋白耐储存。病毒刺突蛋白耐储存。病毒刺突蛋白耐储存。

【技术实现步骤摘要】
一种利用水稻胚乳细胞特异表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，特别是涉及一种利用水稻胚乳细胞特异表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]疫苗作为预防新冠病毒感染的手段之一，是目前全球都在攻克的难题。重组冠状病毒蛋白疫苗具有安全性和免疫原性好等特点，是新冠病毒预防的重要手段。传统方法通常在原核系统或者动物细胞表达，然而原核生物作为生物反应器不具备真核生物的蛋白质翻译后加工系统，很多功能蛋白依赖翻译后修饰如糖基化、磷酸化。酵母细胞的修饰/加工系统与真核生物相比不尽完善也限制了广泛应用。目前第三代生物反应器通常利用动物细胞和转基因动物来生产，然而动物细胞培养和转基因动物不能克服病原菌的污染问题加上生产成本极高等问题，使得该技术在医药市场上的应用受到限制，远远不能满足全球市场需求。
[0003]使用植物来表达重组蛋白具有生产成本低、没有病原菌的污染以及适合大规模生产等优势。如美国的肯塔基周KBP公司在烟草叶片中瞬时表达新冠病毒蛋白且能引发免疫反应的报道，然而烟草叶片表达系统具有不耐贮存、瞬时表达不稳定的缺点从而限制其应用。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用水稻胚乳细胞特异表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体及其应用。本专利技术提供的重组启动子可以使新冠病毒刺突蛋白在水稻胚乳细胞中稳定表达，从而使新冠病毒刺突蛋白在水稻种子中大量积累，且制备的新冠病毒刺突蛋白耐储存。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种启动表达新冠病毒刺突蛋白的重组启动子，所述重组启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种用于扩增上述重组启动子的引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术还提供了一种利用PCR扩增得到上述重组启动子的方法，PCR扩增反应程序包括：94～95℃预变性2min；94～95℃变性20s，56～58℃退火20s，72℃延伸130～150s，循环32次；72℃延伸10min。
[0009]优选的，PCR扩增反应体系以25μL计，包括：2
×
KOD PCR buffer 12.5μL，KOD FX 0.25μL，dNTP 2μL，上述引物组的上游引物和下游引物各0.5μL，DNA模板2μL和余量的ddH2O。
[0010]本专利技术还提供了一种表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体，所述表达载体包括上述的重组启动子和新冠病毒刺突蛋白的编码基因。
[0011]优选的，所述新冠病毒刺突蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]优选的，所述表达载体的基础载体包括pCUbi
‑
1390。
[0013]本专利技术还提供了上述重组启动子或上述引物组或利用上述方法扩增得到的重组启动子或上述表达载体在制备新冠病毒刺突蛋白中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种利用水稻胚乳细胞制备新冠病毒刺突蛋白的方法，包括以下步骤：
[0015]将上述的启动子插入pCUbi1390的HindIII和KpnI酶切位点之间，得到pGt1A1390载体；
[0016]将所述新冠病毒刺突蛋白的编码基因插入所述pGt1A1390载体的Kpn I和BamH I酶切位点之间，得到pGt1A1390
‑
SP1载体；所述新冠病毒刺突蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0017]将pGt1A1390
‑
SP1载体转化到水稻愈伤组织中，经筛选得到表达新冠病毒刺突蛋白的水稻植株。
[0018]优选的，所述筛选的物质包括潮霉素。
[0019]有益效果：
[0020]本专利技术提供一种启动表达新冠病毒刺突蛋白的重组启动子，所述重组启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发利用水稻的胚乳细胞的蛋白体作为重组蛋白的贮存点，通过水稻胚乳特异性表达的重组启动子，介导重组新冠病毒刺突蛋白进入胚乳细胞的内膜系统并储存至胚乳细胞的蛋白体中，从而达到大量生产的目的，表达稳定，且制备的新冠病毒刺突蛋白耐储存。
附图说明
[0021]图1为pCUbi1390载体结构示意图；
[0022]图2为pGt1A1390
‑
SP1载体构建结构示意图；
[0023]图3为pGt1A1390
‑
SP1载体部分片段结构示意图；
[0024]图4为实施例4中SP1胚乳特异性过表达转基因植株的PCR检测电泳图；
[0025]图5为SP1胚乳特异性过表达部分转基因植株的表达量分析结果图。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供一种启动表达新冠病毒刺突蛋白的重组启动子，所述重组启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：TTGTTTTTCACCCTCAATATTTGGAAACATTTATCTAGGTTGTTTGTGTCCAGGCCTATAAATCATACATGATGTTGTCGTATTGGATGTGAATGTGGTGGCGTGTTCAGTGCCTTGGATTTGAGTTTGATGAGAGTTGCTTCTGGGTCACCACTCACCATTATCGATGCTCCTCTTCAGCATAAGGTAAAAGTCTTCCCTGTTTACGTTATTTTACCCACTATGGTTGCTTGGGTTGGTTTTTTCCTGATTGCTTATGCCATGGAAAGTCATTTGATATGTTGAACTTGAATTAACTGTAGAATTGTATACATGTTCCATTTGTGTTGTACTTCCTTCTTTTCTATTAGTAGCCTCAGATGAGTGTGAAAAAAACAGATTATATAACTTGCCCTATAAATCATTTGAAAAAAATATTGTACAGTGAGAAATTGATATATAGTGAATTTTTAAGAGCATGTTTTCCTAAAGAAGTATATATTTTCTATGTACAAAGGCCATTGAAG
NO.4所示：ATGTTTGTGTTCCTCGTCCTCCTCCCGCTCGTCTCCTCCCAGTGCGTCAACCTCACCACCAGGACTCAGCTGCCGCCGGCGTACACCAACAGCTTCACCCGCGGCGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCCGCTCCTCCGTCCTCCACTCCACCCAGGACCTCTTCCTCCCCTTCTTCTCCAACGTCACCTGGTTCCACGCCATCCACGTCTCCGGCACCAACGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCGGTGCTCCCCTTCAACGACGGCGTCTACTTCGCCTCCACCGAGAAGAGCAACATCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动表达新冠病毒刺突蛋白的重组启动子，其特征在于，所述重组启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种用于扩增权利要求1所述重组启动子的引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种利用PCR扩增得到权利要求1所述重组启动子的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序包括：94～95℃预变性2min；94～95℃变性20s，56～58℃退火20s，72℃延伸130～150s，循环32次；72℃延伸10min。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系以25μL计，包括：2
×
KOD PCR buffer 12.5μL，KOD FX 0.25μL，dNTP 2μL，权利要求2所述引物组的上游引物和下游引物各0.5μL，DNA模板2μL和余量的ddH2O。5.一种表达新冠病毒刺突蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1所述的重组启动子和新冠病毒刺突蛋白的编码基因。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪永波，占小登，郑元庭，赵海涵，练旺民，曹立勇，程式华，张迎信，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：