一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法，优化适合于脑胶质瘤检测的WES探针设计，尤其是优化了7号和10号染色体的探针设计，保证高捕获率，高覆盖率；通过DNA提取试剂盒提取肿瘤样本的DNA，然后使用Illumina建库试剂盒建库；通过Illumina测序仪测序,下机的fastq数据经过Trimmomatic处理，主要对接头序列和低质量序列进行过滤；本发明专利技术基于NGS的全外显子组测序的拷贝数变异分析技术检测脑胶质瘤第7号染色体获得和第10号染色体缺失（+7/

【技术实现步骤摘要】
一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法


[0001]本专利技术涉及脑胶质瘤染色体的检测领域，具体为一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法。

技术介绍

[0002]目前常用于检测脑胶质瘤+7/
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10染色体缺失的技术方法主要有：FISH技术、 Karyotype Analysis技术、CMA技术、荧光实时定量PCR 检测技术。
[0003]FISH技术即原位杂交技术，该技术的原理是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。该技术需要+7/
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10探针，试验流程是：样本准备
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脱蜡
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预处理
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消化
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冲洗
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杂交
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洗涤
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DAPI染色。值得一提的是，该技术是检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化情况的金标准。
[0004]Karyotype Analysis技术即染色体核型分析技术，是以分裂中期染色体为研究对象，也称之为，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。多年来，染色体核型分析技术一直被认为是确诊染色体畸变的“金标准”，也是染色体病产前诊断的一线方法，550条带分析分辨率可达到5M，该方法也可以用于检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化情况。
[0005]CMA技术即染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技术，又被称为“分子核型分析”，能够在全基因组水平进行扫描，可检测染色体不平衡的拷贝数变异(copy number variant，CNV)，尤其是对于检测染色体组微小缺失、重复等不平衡性重排具有突出优势。根据芯片设计与检测原理的不同，CMA技术可分为两大类：基于微阵列的比较基因组杂交(array．based comparative genomic hybridization，aCGH)技术和单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism array．SNP array)技术。前者需要将待测样本DNA与正常对照样本DNA分别标记、进行竞争性杂交后获得定量的拷贝数检测结果，而后者则只需将待测样本DNA与一整套正常基因组对照资料进行对比即可获得诊断结果。通过aCGH技术能够很好地检出CNV，而SNP array除了能够检出CNV外，还能够检测出大多数的单亲二倍体(uniparental disomv，UPD)和三倍体，并且可以检测到一定水平的嵌合体。而设计涵盖CNV+SNP检测探针的芯片，可同时具有CNV和SNP芯片的特点，该方法也可以用于检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化情况。
[0006]荧光实时定量PCR 检测技术作为较早出现的检测目的区段DNA 拷贝数的方法，主要可以通过检测PCR 反应体系中的荧光强度来实现对初始样品的某个DNA 片段的拷贝数进行定量。最为常用的方法是通过SYBR Green 嵌入DNA 双链发光原理来实现对DNA 的定量，然后运用已知为2 拷贝的DNA 标准品作为内参校正， 从而对目的DNA 片段的拷贝数进行确认，该方法也可以用于检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化情况。
[0007]但是FISH技术检测胶质瘤胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化虽然是检测该分子标志物的金标准，但对胶质瘤的诊断存在几点不足：第一，FISH检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化流程较为繁琐，所需时间较长；第二FISH检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化的结果判断过程费时费力，各需要计算100个细胞中的荧光个数。第三胶质瘤的诊断不仅需要用FISH技术检测胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化这一分子标志物，还需用别的检测技术检测IDH、EGFR等分子标志物，单个FISH技术不能满足胶质瘤主要分子标志物的一次性检测。
[0008]染色体核型分析技术是染色体病产前诊断的一线方法，但实体肿瘤染色体标本制作比较困难，操作繁琐，收获时间长，任何一个步骤操作不当，均可影响染色体标本制备的最终效果。因此各类肿瘤组织目前还难以用同一种方法去处理，所以在应用到研究胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化可能需要反复摸索合适的条件。
[0009]与染色体核型分析技术相比，CMA不需要进行细胞培养，分辨率高出进千倍，几乎可用于任何组织的DNA分析。CMA可在全基因组范围内同时检测到很多种染色体不平衡导致的遗传性疾病，可检测到染色体的微重复和微缺失，并能客观准确的界定CNV的区间及大小。CMA快速方便，具有高度的灵敏性和准确性，可同时检测多种疾病或多个检测位点，可以用来分析胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化，但是需要额外购买这样的芯片，缺点同样是不能满足一次性进行胶质瘤其他分子标志物IDH、TERT和EGFR等检测。
[0010]实时荧光定量PCR微卫星分析技术胶质瘤+7/
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10染色体拷贝数变化需要设计大量的引物，这也是一笔不小的费用，缺点同样是不能满足一次性进行胶质瘤其他分子标志物IDH、TERT和EGFR等检测。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
[0012]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法，具体方法如下步骤：S1：优化适合于脑胶质瘤检测的WES探针设计，尤其是优化了7号和10号染色体的探针设计，保证高捕获率，高覆盖率；S2：通过DNA提取试剂盒提取肿瘤样本的DNA，然后使用Illumina建库试剂盒建库；S3：通过Illumina测序仪测序,下机的fastq数据经过Trimmomatic处理，主要对接头序列和低质量序列进行过滤；S4：通过比对软件bwa将fastq比对到参考基因组，然后通过samtools把比对得到的sam文件变为bam文件，再通过Gatk4对bam文件标记重复、碱基质量进行矫正，从而得到作为拷贝数变异分析的bam文件；S5：通过等位基因特异性的拷贝数分析软件提取需要分析的基因组区域，基于dbSNP和1000genome数据库制作一个人群数据库的胚系的单核苷酸多态性（SNP）位点文件，基于覆盖范围很大的WES测序，但是某些位点深度不是很深的特点优化软件参数，将得到的含有染色体位置信息，拷贝数信息的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于NGS的CNV分析检测脑胶质瘤染色体的方法，其特征在于：具体方法如下步骤：S1：优化适合于脑胶质瘤检测的WES探针设计，尤其是优化了7号和10号染色体的探针设计，保证高捕获率，高覆盖率；S2：通过DNA提取试剂盒提取肿瘤样本的DNA，然后使用Illumina建库试剂盒建库；S3：通过Illumina测序仪测序,下机的fastq数据经过Trimmomatic处理，主要对接头序列和低质量序列进行过滤；S4：通过比对软件bwa将fastq比对到参考基因组，然后通过samtools把比对得到的sam文件变为bam文件，再通过Gatk4对bam文件标记重复、碱基质量进行矫正，从而得到作为拷贝数变异分析的bam文件；S5：通过等位基因特异性的拷贝数分析软件提取需要分析的基因组区域，基于dbSNP和1000genome数据库制作一个人群数据库的胚系的单核苷酸多态性（SNP）位点文件，基于覆盖范围很大的WES测序，但是某些位点深度不是很深的特点优化软件参数，将得到的含有染色体位置信息，拷贝数信息的拷贝数变...

【专利技术属性】
技术研发人员：李唐建，
申请(专利权)人：阔然生物医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：