一种检测BRAFV600E位点的数字PCR反应体系及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。所述反应体系包含BRAF V600E位点的特异性扩增引物和野生型、突变型探针，通过优化PCR扩增体系中引物探针的浓度比例，使得整个反应体系的灵敏度和稳定性大幅度提高。本发明专利技术适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸等等微量样本中检测灵敏度高，结果准确可靠，具有较高的应用价值。较高的应用价值。较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用


[0001] 本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。

技术介绍

[0002]BRAF基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在肿瘤患者中最常见的突变是第15号外显子上的V600E突变。BRAF V600E突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。研究表明，BRAF V600E突变预示Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌患者预后不良。NCCN指南推荐的Lynch综合征的检测策略中，推荐在DNA错配修复蛋白缺失的病例中进行BRAF基因突变检测。BRAF是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，BRAF V600E突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，期和Ⅱ期临床试验证明携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，BRAF基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。
[0003]有研究表明，肿瘤患者的血液、胸腹腔积液、脑脊液等体液中可以检测到的游离DNA含量远大于正常人，并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性。随着肿瘤分子生物学研究的进展，游离DNA的检测及其生物学指标的研究已为临床肿瘤早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特意、无创或微创的分子生物学检测手段。
[0004]本申请提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，检测灵敏度高，特异性好，在相关癌症的诊疗应用中有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，所述体系通过优化检测条件及引物浓度，最终实现了对多种类型样本的高效、准确和灵敏的检测，尤其是在微量核酸的检测中具有较高的优势，适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸样本的检测中具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAF V600E位点的特异性探针组成：（1）所述特异性引物包括：BRAF V600E正向引物：5
’‑
GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
‑3’
，BRAF V600E反向引物：5
’‑
ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC
‑3’
；（2）所述特异性探针包括：
BRAF V600E野生型探针：5
’‑
CTAGCTACAGTGAAATC
‑3’
，BRAF V600E突变型探针：5
’‑
TAGCTACAGAGAAATC
‑3’
。优选地，所述野生型探针5
’
端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5
’
端具有FAM荧光基团修饰。
[0007]优选地，所述野生型探针和突变型探针的3
’
末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸。
[0008]更加优选地，所述探针的3
’
末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。
[0009]优选地，所述反应体系由10*引物探针混合物、ddPCR
‑
酶反应液、模板DNA和去离子水组成。
[0010]例如，本专利技术中，若所述反应体系的总体积为20μL，则其中10
×
引物探针混合物2.0μL、dPCR
‑
酶反应液10μL、模板DNA 1
‑
8μL，去离子水补齐至20μL。
[0011]优选地，所述引物探针混合物的浓度分别为：BRAF V600E正向引物浓度为5.5
‑
8.0μmol/L；BRAF V600E反向引物浓度为5.5
‑
8.0μmol/L；BRAF V600E野生型探针浓度为2.5
‑
4.0μmol/L；BRAF V600E突变型探针浓度为2.5
‑
4.0μmol/L。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用，所述反应体系用于检测血浆游离DNA 中BRAF V600E位点突变。
[0013]优选的，检测血浆游离DNA 中BRAF V600E位点突变方法包括如下步骤：(1) 提取样本中的DNA；(2) 采用由10
×
引物探针混合物、dPCR
‑
酶反应液、模板DNA和去离子水组成的反应体系配制扩增反应；(3) 按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60
‑
65℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；(4) 通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到样本中的DNA的BRAF V600E位点的突变情况，计算突变比例信息。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术提供的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，具有较高的特异性和灵敏性，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确可信；（2）本专利技术提供的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，对于血浆游离DNA这一类低丰度的样本类型，检测成功率高，避免了反复检测、反复取样等实际问题，大幅度缩短检测周期，在临床检验中具有较高的应用价值。
[0015]（3）本专利技术提供的扩增体系操作简单，整个检测流程所需时间短，方便操作，结果直观，便于分析，检测结果更为准确、灵敏；本专利技术提供的反应体系可大规模用于分析临床样本，提供准确稳定的检测结果。
[0016]附图说明
[0017]图1为采用本专利技术检测的血液样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；图2为采用本专利技术检测的血液样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；图3为采用本专利技术检测的肿瘤组织样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；图4为采用本专利技术检测的肿瘤组织样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；图5为采用本专利技术检测的血浆游离DNA样本1在BRAF V600E位点的基因分型结果；图6为采用本专利技术检测的血浆游离DNA样本2在BRAF V600E位点的基因分型结果；图7为采用本专利技术检测的血浆游离DNA样本3在BRAF V600E位点的基因分型结果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，包含引物探针混合物，其特征在于，所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAF V600E位点的特异性探针组成：（1）所述特异性引物的序列，其特征在于：BRAF V600E正向引物：5
’‑
GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
‑3’
，BRAF V600E反向引物：5
’‑
ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC
‑3’
；（2）所述特异性探针的序列，其特征在于：BRAF V600E野生型探针：5
’‑
CTAGCTACAGTGAAATC
‑3’
，BRAF V600E突变型探针：5
’‑
TAGCTACAGAGAAATC
‑3’
。2.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述野生型探针5
’
端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5
’
端具有FAM荧光基团修饰。3.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征在于，所述野生型探针和突变型探针的3
’
末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸；优选地，所述探针的3
’
末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。4.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐梅波，王雨倩，
申请(专利权)人：远辰生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：