PDCD-1归巢核酸内切酶变体制造技术

本公开提供了被重编程以结合并切割PDCD‑1基因的改善的归巢核酸内切酶变体和megaTAL。本公开涉及具有改善的稳定性和活性的基因组编辑组合物。更具体地，本公开涉及改善的核酸酶变体、组合物和使用它们编辑人程序性细胞死亡(PDCD‑1)基因的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PDCD-1归巢核酸内切酶变体相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年12月10日提交的美国临时申请第62/777,471号的权益，以上申请以引用的方式整体并入本文。关于序列表的声明与本申请相关联的序列表是以文本格式提供以代替纸质副本，并以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_109_01WO_ST25.txt。文本文件是95KB，创建于2019年11月26日，并在本说明书提交的同时，通过EFS-Web以电子方式提交。
技术介绍

本公开涉及具有改善的稳定性和活性的基因组编辑组合物。更具体地，本公开涉及改善的核酸酶变体、组合物和使用它们编辑人程序性细胞死亡1(PDCD-1)基因的方法。现有技术全球癌症负担在1975年与2000年间翻倍。癌症是世界范围内导致发病率和死亡率的第二大主导原因，并且在2012年间有约1410万例新增病例和820万例癌症相关死亡。最常见的癌症是乳癌、肺和支气管癌、前列腺癌、结肠和直肠癌症、膀胱癌、皮肤黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、甲状腺癌、肾脏和肾盂癌、子宫内膜癌、白血病以及胰腺癌。预计在接下来的二十年里新增癌症病例的数量将增加至2200万例。免疫系统在人癌症检测和防治中具有关键作用。大部分的转化细胞被免疫哨兵(immunesentinel)迅速地检测到并且通过克隆地表达的T细胞受体(TCR)活化抗原特异性T细胞而破坏。因此，癌症可以被视为一种免疫病症，即免疫系统无法产生必要的抗肿瘤反应以持久地抑制和消除疾病。为了更有效地对抗癌症，在过去数十年里开发出的某些免疫治疗干预专门地集中在增强T细胞免疫。这些治疗仅有偶然的疾病缓解病例，但没有取得显著的总体成功。使用靶向抑制T细胞活化的分子的单克隆抗体，如CTLA-4或PDCD-1的更近期的疗法已经显示出更显著的抗肿瘤效应；然而，这些治疗还与由于全身性免疫活化而引起的显著毒性相关。最近，已经在研究基于T细胞分离、修饰、扩增和再输注的过继性细胞免疫疗法策略并在早期临床试验中进行测试。由于T细胞具有选择性识别和强效的效应子机制，故这些细胞通常是选择用于癌症免疫疗法的效应细胞。这些治疗显示出一定的成功率，而且少量患者经历持久的缓解，突出显示了基于T细胞的免疫疗法的尚未实现的潜力。细胞溶解T细胞成功地识别肿瘤细胞相关抗原引起靶肿瘤溶解并且成为任何有效癌症免疫疗法的基础。肿瘤浸润性T细胞(TIL)表达特异性针对肿瘤相关抗原的TCR；不过，大量的TIL仅局限于少数人类癌症。工程改造的T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)潜在地增加基于T细胞的免疫疗法在许多癌症和其它免疫病症中的适用性。此外，现有技术工程改造的T细胞还受到复杂免疫抑制肿瘤微环境的调控，所述免疫抑制肿瘤微环境由癌细胞、炎性细胞、基质细胞和细胞因子组成。在这些组分中，癌细胞、炎性细胞和抑制性细胞因子调节T细胞表型和功能。总体来说，肿瘤微环境驱使T细胞终末分化成耗竭T细胞。T细胞耗竭是在持续环境中以抑制性受体表达增加或抑制性受体引起的信号传导增加；效应细胞因子产生减少；以及持续存在和消除癌症的能力降低为标志的T细胞功能障碍状态。耗竭T细胞还以分级方式显示功能损失：在耗竭早期，IL-2产生减少且离体杀灭能力丧失；在中期，无法产生TNF-α；以及在耗竭晚期，无法产生IFN-γ和GzmB。大部分T细胞在肿瘤微环境中分化成耗竭T细胞并丧失消除癌症的能力，并且最终被清除。程序性细胞死亡1(PDCD-1)在T细胞上表达，并通过与肿瘤微环境中存在的免疫抑制因子(例如PD-L1和PD-L2)结合来介导免疫抑制。PD-L1和PD-L2的表达与某些人类恶性肿瘤的预后相关。PD-L1/PDCD-1信号传导路径是T细胞耗竭的重要调节路径之一。PD-L1在癌细胞和基质细胞中大量表达，并且使用单克隆抗体阻断PD-L1/PDCD-1会增强T细胞抗肿瘤功能。PD-L2还与PDCD-1结合并负向调节T细胞功能。
技术实现思路
本公开总体上部分地涉及包含归巢核酸内切酶变体和megaTAL的组合物及其使用方法，所述归巢核酸内切酶变体和megaTAL具有改善的稳定性和活性，并且切割人PDCD-1基因中的靶位点。在各种实施方案中，本专利技术部分地涵盖包含工程改造的归巢核酸内切酶的多肽，所述工程改造的归巢核酸内切酶已经被工程改造以改善稳定性以及靶位点的结合和切割。在各种实施方案中，多肽包含I-OnuI归巢核酸内切酶(HE)变体。在各种实施方案中，提供了切割人程序性细胞死亡1(PDCD-1)基因中的靶位点的I-OnuI归巢核酸内切酶(HE)变体，该I-OnuIHE变体包含以下氨基酸取代：SEQIDNO:1-5中任一者所示的I-OnuIHE氨基酸序列或其生物活性片段中的I14T、L26G、R28S、R30L、N32R、K34R、S35G、S36T、V37A、G38R、S40H、E42R、G44S、Q46T、T48M、V68S、A70L、S72N、N75H、A76Y、K80V、T82Y、R83A、L138M、T143N、N153V、K156R、S159P、F168G、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、T240E、V261M和G300R。在优选的实施方案中，I-OnuIHE变体不包含SEQIDNO:15-20中任一者所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、3、4、5、6、7或8个N末端氨基酸。在附加的实施方案中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏4个N末端氨基酸。在某些施方案中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏8个N末端氨基酸。在特定实施方案中，相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏1、2、3、4或5个C末端氨基酸。在特定实施方案中，其中相较于相应野生型HE，所述生物活性片段缺乏C末端氨基酸。在一些实施方案中，相比之下，所述生物活性片段缺乏2个C末端氨基酸。在特定实施方案中，I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少95％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少96％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少97％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少98％同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其包含切割人程序性细胞死亡1(PDCD-1)基因中的靶位点的I-OnuI归巢核酸内切酶(HE)变体，所述I-OnuI HE变体包含以下氨基酸取代：SEQ ID NO:1-5中任一者所示的I-OnuI HE氨基酸序列或其生物活性片段中的I14T、L26G、R28S、R30L、N32R、K34R、S35G、S36T、V37A、G38R、S40H、E42R、G44S、Q46T、T48M、V68S、A70L、S72N、N75H、A76Y、K80V、T82Y、R83A、L138M、T143N、N153V、K156R、S159P、F168G、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、T240E、V261M和G300R。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181210 US 62/777,4711.一种多肽，其包含切割人程序性细胞死亡1(PDCD-1)基因中的靶位点的I-OnuI归巢核酸内切酶(HE)变体，所述I-OnuIHE变体包含以下氨基酸取代：SEQIDNO:1-5中任一者所示的I-OnuIHE氨基酸序列或其生物活性片段中的I14T、L26G、R28S、R30L、N32R、K34R、S35G、S36T、V37A、G38R、S40H、E42R、G44S、Q46T、T48M、V68S、A70L、S72N、N75H、A76Y、K80V、T82Y、R83A、L138M、T143N、N153V、K156R、S159P、F168G、E178D、C180S、N184R、I186R、K189N、S190V、K191N、L192A、G193R、Q195R、S201E、T203S、K207R、Y223H、K225Y、K227G、F232R、D236Q、V238R、T240E、V261M和G300R。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述I-OnuIHE变体包含与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述I-OnuIHE变体包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列或其生物活性片段。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述I-OnuIHE变体结合SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述I-OnuIHE变体结合SEQIDNO:10所示的多核苷酸序列。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，还包含DNA结合结构域。


7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述DNA结合结构域选自由以下组成的组：TALEDNA结合结构域和锌指DNA结合结构域。


8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述TALEDNA结合结构域包含约9.5个TALE重复单元至约15.5个TALE重复单元。


9.根据权利要求7或权利要求8所述的多肽，其中所述TALEDNA结合结构域结合SEQIDNO:9所示的多核苷酸序列。


10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述多肽结合并切割SEQIDNO:10所示的多核苷酸序列。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，还包含肽接头和末端加工酶或其生物活性片段。


12.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，还包含病毒自裂解2A肽和末端加工酶或其生物活性片段。


13.根据权利要求11或权利要求12所述的多肽，其中所述末端加工酶或其生物活性片段具有5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶、5'活瓣核酸内切酶、解螺旋酶或非模板依赖性DNA聚合酶活性。


14.根据权利要求11至13中任一项所述的多肽，其中所述末端加工酶包含Trex2或其生物活性片段。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或其生物活性片段具有至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或其生物活性片段。


17.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的多肽。


18.一种mRNA，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的多肽。


19.根据权利要求18所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示的序列。


20.根据权利要求18所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQIDNO:11所示的序列。


21.根据权利要求18所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQIDNO:12所示的序列。


22.一种cDNA，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的I-OnuIHE变体。


23.根据权利要求22所述的cDNA，其中从所述cDNA转录的mRNA包含SEQIDNO:11所示的序列。


24.根据权利要求22所述的cDNA，其中从所述cDNA转录的mRNA包含SEQIDNO:12所示的序列。


25.一种载体，其包含编码权利要求1至16中任一项所述的多肽的多核苷酸；编码权利要求18至21中任一项所述的mRNA的多核苷酸；或编码权利要求22-24任一项的cDNA的多核苷酸。


26.根据权利要求25所述的载体，其中所述载体是表达载体、附加型载体或病毒载体。


27.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔丹·贾儒尔，凯尔·哈文斯，贾斯迪普·曼恩，
申请(专利权)人：蓝鸟生物公司，
类型：发明
国别省市：美国;US