使用逆转录病毒整合酶-Cas9融合蛋白通过定向非同源DNA插入进行的基因组编辑制造技术

本发明专利技术提供了用于编辑基因组物质的融合蛋白以及相关的核酸、系统和方法，所述融合蛋白包含逆转录病毒整合酶和Cas蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用逆转录病毒整合酶-Cas9融合蛋白通过定向非同源DNA插入进行的基因组编辑相关申请的交叉引用本申请要求2018年10月22日提交的美国临时申请序列号62/748,703的优先权，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。专利技术背景CRISPR-Cas9大大提高了为基础研究和临床应用快速改变哺乳动物基因组的能力。CRISPR-Cas9使用向导RNA来将Cas9引导至特异性DNA靶序列，在其中它诱导双链DNA裂解并触发细胞修复途径，以引入移码突变或通过同源定向修复(HDR)插入供体序列。尽管取得了这些重大进展，但靶向递送大DNA序列以使用CRISPR-Cas9介导的HDR进行基因组编辑的效率仍然低下，需要含有显著侧翼同源性区域的供体模板并诱导p53DNA损伤途径(Byrne等人,2015,NAR43:e21；Happaniemi等人,2018,NatMed24:927-30；Ihry等人,2018,NatMed24:939-46)。总之，这些大大限制了CRISPR-Cas9基因组编辑的效率。因此，需要改进的整合基因组编辑。相比之下，通过不需要靶序列同源性的方法，慢病毒酶整合酶(IN)对于催化大的慢病毒基因组插入宿主细胞DNA中而言是必要且足够的。IN介导的慢病毒DNA插入在几乎没有DNA靶序列特异性情况下发生，部分是由于其C末端结构域与DNA非特异性结合(Lutzke和Plasterk1998,JVirol72:4841-48)。基因治疗技术的当前局限性阻止了大多数人类单基因疾病的治疗。CRISPR-Cas9基因编辑一直是开发治疗方法以校正哺乳动物基因组中的有害突变的新焦点。由于人类基因组内可能引起疾病和病症的众多患者特异性突变，这仍然是重大挑战。设计用于靶向外显子-内含子边界的CRISPR向导RNA可允许外显子跳跃策略以靶向这些突变组，然而，这些策略的功效仍有待测试并且不适用于所有患者。许多基因的转基因表达可预防和逆转动物模型中的疾病结果，然而一些基因的大的尺寸大大超出了传统基因编辑方法(如CRISPR-Cas9)或传统病毒基因治疗方法如AAV(约4.9kb限制)的尺寸限制，从而阻止其用于人类基因疗法。使用通关AAV递送的较小工程化基因的方法目前正在临床试验中，然而这些策略是否提供长期恢复并且仅适用于具有特定突变的患者尚待确定。相比之下，慢病毒载体能够递送大基因并通过整合到宿主基因组中允许永久性校正。然而，目前慢病毒整合的随机性质有可能导致脱靶突变和疾病，这阻止了其用于临床应用(Milone等人,2018,Leukemia23:1529-41)。慢病毒序列通过病毒编码的酶整合酶(IN)插入宿主基因组中，所述酶利用基因组整合所需的非特异性DNA结合结构域(Andrake等人,2015,AnnuRevVirol2:241-64)。因此，需要改进的编辑基因组物质。本专利技术满足了这一需求。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了一种融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含具有第一氨基酸序列的逆转录病毒整合酶(IN)或其片段；具有第二氨基酸序列的CRISPR相关(Cas)蛋白；以及具有第三氨基酸序列的核定位信号(NLS)。在一个实施方案中，所述逆转录病毒IN选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)IN、劳斯肉瘤病毒(RSV)IN、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)IN、莫洛尼鼠白血病病毒(MoLV)IN、牛白血病病毒(BLV)IN、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)IN、禽肉瘤白血病病毒(ASLV)IN、猫白血病病毒(FLV)IN、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)IN、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)IN、猫免疫缺陷病毒(FIV)IN、马传染性贫血病毒(EIAV)IN、原型泡沫病毒(PFV)IN、猿猴泡沫病毒(SFV)IN、人泡沫病毒(HFV)IN、大眼鲈皮肤肉瘤病毒(WDSV)IN和牛免疫缺陷病毒(BIV)IN。在一个实施方案中，所述逆转录病毒IN片段包含INN末端结构域(NTD)和IN催化核心结构域(CCD)。在一个实施方案中，所述逆转录病毒IN包含与SEQIDNO:1-40中的一者至少70％同一的序列。在一个实施方案中，所述逆转录病毒IN包含SEQIDNO:1-40中的一者的序列。在一个实施方案中，所述Cas蛋白选自由以下组成的组：Cas9、Cas13和Cpf1。在一个实施方案中，所述Cas蛋白是催化缺陷型的(dCas)。在一个实施方案中，所述Cas蛋白包含与SEQIDNO:41-46中的一者至少95％同一的序列。在一个实施方案中，所述Cas蛋白包含SEQIDNO:41-46中的一者的序列。在一个实施方案中，所述NLS是逆转录转座子NLS。在一个实施方案中，所述逆转录转座子NLS是Ty1或Ty2NLS。在一个实施方案中，所述NLS是Ty1样NLS。在一个实施方案中，所述NLS包含与SEQIDNO:47-56、254-257和275-887中的一者至少70％同一的序列。在一个实施方案中，所述NLS包含SEQIDNO:47-56、254-257和275-887中的一者的序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQIDNO:57-98中的一者至少70％同一的序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:57-98中的一者的序列。在一个方面，本专利技术提供了一种编码本专利技术的融合蛋白的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含与SEQIDNO:155-196中的一者至少70％同一的序列。在一个实施方案中，所述核酸包含选自SEQIDNO:155-196的序列。在一个方面，本专利技术提供了一种编辑遗传物质的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述遗传物质施用：(a)本专利技术的融合蛋白或编码本专利技术的融合蛋白的核酸分子，(b)包含与所述遗传物质中的靶区域互补的靶向核苷酸序列的向导核酸，以及(c)包含U3序列、U5序列和供体模板序列的供体模板核酸。在一个实施方案中，所述编辑遗传物质的方法是体外方法。在一个实施方案中，所述编辑遗传物质的方法是体内方法。在一个方面，本专利技术提供了一种用于编辑遗传物质的系统。在一个实施方案中，所述系统在一种或多种载体中包含：(a)编码本专利技术的融合蛋白的核酸序列，(b)编码CRISPR-Cas系统向导RNA的核酸序列，和(c)编码供体模板核酸的核酸序列，其中所述供体模板核酸包含U3序列、U5序列和供体模板序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含逆转录病毒整合酶(IN)或其片段；CRISPR相关(Cas)蛋白和核定位信号(NLS)。在一个实施方案中，所述核酸位于同一载体上。在一个实施方案中，所述核酸位于不同的载体上。在一个实施方案中，所述CRISPR-Cas系统向导RNA基本上与所述基因中的靶DNA序列杂交。在一个实施方案中，所述U3序列和U5序列对所述逆转录病毒IN具有特异性。在方面，本专利技术提供了一种用于递送基因组编辑组分的系统。在一个实施方案中，所述系统包含：(a)包装质粒，所述包装质粒包含编码gag-pol多蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：/na)具有第一氨基酸序列的逆转录病毒整合酶(IN)或其片段；/nb)具有第二氨基酸序列的CRISPR相关(Cas)蛋白；以及/nc)具有第三氨基酸序列的核定位信号(NLS)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181022 US 62/748,7031.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
a)具有第一氨基酸序列的逆转录病毒整合酶(IN)或其片段；
b)具有第二氨基酸序列的CRISPR相关(Cas)蛋白；以及
c)具有第三氨基酸序列的核定位信号(NLS)。


2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述逆转录病毒IN选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)IN、劳斯肉瘤病毒(RSV)IN、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)IN、莫洛尼鼠白血病病毒(MoLV)IN、牛白血病病毒(BLV)IN、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)IN、禽肉瘤白血病病毒(ASLV)IN、猫白血病病毒(FLV)IN、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)IN、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)IN、猫免疫缺陷病毒(FIV)IN、马传染性贫血病毒(EIAV)IN、原型泡沫病毒(PFV)IN、猿猴泡沫病毒(SFV)IN、人泡沫病毒(HFV)IN、大眼鲈皮肤肉瘤病毒(WDSV)IN和牛免疫缺陷病毒(BIV)IN。


3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述逆转录病毒IN片段包含INN末端结构域(NTD)和IN催化核心结构域(CCD)。


4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Cas蛋白选自由以下组成的组：Cas9、Cas13和Cpf1。


5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Cas蛋白是催化缺陷型的(dCas)。


6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述NLS是逆转录转座子NLS。


7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中所述逆转录转座子NLS是Ty1NLS。


8.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述逆转录病毒IN包含与SEQIDNO:1-40中的一者至少70％同一的序列。


9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述逆转录病毒IN包含选自SEQIDNO:1-40的序列。


10.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Cas蛋白包含与SEQIDNO:41-46中的一者至少95％同一的序列。


11.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Cas蛋白包含选自SEQIDNO:41-46的序列。


12.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述NLS包含与SEQIDNO:47-56中的一者至少70％同一的序列。


13.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述NLS包含选自SEQIDNO:47-56的序列。


14.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQIDNO:57-98中的一者至少70％同一的序列。


15.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQIDNO:57-98的序列。


16.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1-15中任一项所述的融合蛋白。


17.如权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸包含与SEQIDNO:155-196中的一者至少70％同一的序列。


18.如权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸包含选自SEQIDNO:155-19...

【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯·马修·安德松，
申请(专利权)人：罗切斯特大学，
类型：发明
国别省市：美国;US