BN2基因及其在植物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种BN2基因及其在植物中的应用。提供了BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。植物体内敲除BN2基因后会显著降低植物体内RNA沉默通路，使得植物对病毒更敏感；BN2基因能够显著促进植物体内RNA沉默信号通路；而且bn2基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高，从而可以用来在植物体内过表达蛋白或者应用于植物抗病育种领域。

【技术实现步骤摘要】
BN2基因及其在植物中的应用
本专利技术涉及植物育种领域，具体涉及一种BN2基因及其在植物中的应用，尤其涉及BN2基因在植物抗病育种领域中的用途。
技术介绍
棉花曲叶病(CottonLeafCurlDisease，CLCuD)是棉花生产种植过程中最具爆发性和毁灭性病害之一，该病是由烟粉風传播的棉花曲叶病毒侵染所致。此病害因1988年在巴基斯坦的木尔坦(Multan)地区大爆发而闻名，随后此病迅速传播至其他国家和地区。由于棉花对该病抗性极低，一旦侵染将会造成棉花的减产甚至绝产，目前棉花曲叶病对整个巴基斯坦、印度及东亚和南亚的棉花生产来说都是最严峻的威胁和挑战(BriddonandMarkham,2000)。截至目前的报道，能引起棉花曲叶病的病毒有10种。其中木尔坦型棉花曲叶病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)是其中发病范围最广、侵染力最强、造成危害最大的病毒(BriddonandMarkham,2000)。CLCuMuV可以侵染棉花、黄秋葵、朱槿、垂花悬铃花等多种寄主作物，并且能实现植株间交叉传染。CLCuMuV侵染后的棉花病株叶片皱缩、向下或向上卷曲，叶脉增厚、膨大，叶背而出现耳状突起，植株矮化，棉花产量急剧降低(Fauquetetal.,2008；Mansooretal.,2006；Sattaretal.,2013)(图1.2)。CLCuMuV属于单组份病毒，基因组含有DNA-A和DNA-β，DNA-β上只编码βC1蛋白。DNA-A可以单独侵染棉花，但病状微弱。DNA-A和DNA-β共同侵染时会诱导典型的棉花曲叶病症状(Sattaretal.,2013)。RNA沉默(RNAsilencing，RANi)是指真核生物通过小RNA(smallRNA，sRNA)靶向基因mRNA从而调节基因的表达的机制。RNA沉默作为生物界保守的防御机制在动物和植物的发育、抗逆境胁迫等方面具有至关重要的作用(Brodersenetal.,2008；ChinnusamyandZhu,2009；HeoandKim,2009)。总体来说，当病毒进入宿主细胞后，便开始利用细胞的酶、底物以及细胞器进行自身自身遗传物质的复制，并转录翻译出病毒蛋白以加快病毒的扩增。而这些大量产生的mRNA、RNA片段会在RNA依赖的RNA合成酶(RNA-dependentRNA-polymerases，RDR)的作用下形成双链dsRNA然后双链dsRNA会被DCL家族蛋白(DICER-LIKE，DCL)和dsRNA结合蛋白(dsRNAbindingproteins，DRB)所识别，然后被剪切成21–24nt大小的小RNA(包括siRNA、miRNA、tasiRNA等)，这些小RNA会进一步被ARGONAUTE(AGO)家族蛋白识别并结合，和其他蛋白一起形成“RNA诱导的沉默复合体”(RNA-inducedsilencingcomplexes，RISCs)。沉默复合体一方面能够结合到靶标mRNA上，从而剪切降解靶标mRNA，实现相关基因的沉默，另一方面RISC结构也可以通过影响染色体的甲基化状态，形成转录水平上的基因沉默(BolognaandVoinnet,2014；MeisterandTuschl,2004；PumplinandVoinnet,2013；Qietal.,2006；Zilbermanetal.,2004)。按照发生的位置和作用机制，植物基因沉默主要分为两个部分，转录水平基因沉默(transcriptionalgenesilence，TGS)和转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilence，PTGS)，两者在植物对双生病毒的抵抗过程中都起到重要的作用。通过RNA沉默调控植物内基因表达，从而改善植物的性能，还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本专利技术涉及一个正调控植物抗双生病毒的基因BN2。双功能核酸酶(BifunctionalNuclease2，BN2)是一个含有核酸酶结构域的酶。专利技术人在研究过程中创造性的发现当植物体内敲除BN2(bn2)基因后会显著降低植物RNAi通路，使得植物对双生病毒更敏感；而且在BN2基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，如GFP蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高。本专利技术应用BN2基因或其活性片段能够用于植物内过表达蛋白、酶活剪切miRNAs及植物抗病育种领域。为此，本专利技术的第一方面提供了一种BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。本专利技术的专利技术人首次创造性的发现基因BN2涉及RNAi通路。后续实验结果证实BN2在抗病过程中起正调控作用，及解析BN2抗病过程的分子机制是通过特异性切割降解调节miRNA水平，进而调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，正向促进转录后基因沉默。而且利用农杆菌在烟草中瞬时过表达的GFP蛋白，发现在bn2敲除植物中，GFP蛋白的表达量有显著提高。因此，本专利技术不仅为植物抗病育种提供重要的理论支持，而且可将bn2基因敲除植物作为生物发生器在植物内过表达蛋白及利用BN2的酶活功能特异性剪切miRNA。本专利技术的第二方面提供了一种BN2基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。本专利技术的第三方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括：使得目标植物体内BN2基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。本专利技术的第四方面提供了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，包括：将外源蛋白的编码基因导入到所述植物体内，以便促进外源蛋白在所述植物中的表达，其中所述植物体内低表达或者不表达BN2基因或其活性片段。本专利技术的第五方面提供了一种表达载体在RNA沉默中的用途，所述表达载体含有BN2基因或其活性片段。根据本专利技术的实施例，所述表达载体为质粒。本专利技术的第六方面提供了一种BN2基因或其活性片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进RNA沉默中的用途。附图说明图1是根据本专利技术的实施例提供的BN2正向调控RNAi结果图。图2是根据本专利技术的实施例提供的BN2能够正向调节AGO1、AGO2、DCL1的mRNA水平结果图。图3是根据本专利技术的实施例提供的Cas9敲除BN2后烟草miR162、miR168、miR403的水平升高的结果图。图4是根据本专利技术的实施例提供的BN2能够剪切降解miRNA的结果图。图5是根据本专利技术的实施例提供的BN2不能剪切Pre-miRNA、RNA和ssDNA的结果图。图6是根据本专利技术的实施例提供的CLCuMuV在bn2转基因烟草上侵染能力增强的结果图。图7是根据本专利技术的实施例提供的PPV在bn2转基因烟草上侵染能力增强的结果图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例作详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在用于解释本专利技术，但本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述BN2基因或其活性片段如SEQIDNO:1所示序列；
任选地，所述BN2基因或其活性片段编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。


3.BN2基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。


4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述BN2基因或其活性片段如SEQIDNO:1所示序列；
任选地，所述BN2基因或其活性片段编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。


5.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括：
使得目标植物体内BN2基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：
使得目标植物体内过表达所述BN2基因或其活性片段；
任选地，将BN2基因或其活性片段导入到目标植物体内，使得目标植物体内过表达所述BN2基因或其活性片段；
任选地，所述BN2基因或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉乐，王韵婧，龚骞，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11