一种非细胞神经移植物的生物测定方法技术

公开了用于生物测定的技术和系统，所述生物测定是使用神经支配外周神经系统的感觉神经元的外周神经产生的体外模拟。在一些实施方式中，所述技术可有助于检测神经移植物（例如，加工的、非细胞的人同种异体移植物）用于促进或支持外周神经再生的生物活性或效力。在各种实施方式中，技术包括：将神经元（例如，DRG）附着到神经移植物片段以形成测试结构；在培养基中培养测试结构；分析测试结构以指示外生长神经结构的数量；并根据分析得出的度量确定神经移植物的效力。在一些实施方式中，可以使用技术和材料来测试不同测试条件对神经生长的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种非细胞神经移植物的生物测定方法相关申请的交叉引用本申请是2015年5月28日提交的共同未决申请14/724,365的部分继续申请，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
在创伤性损伤中，外周神经常常被损坏或切断。这些神经的手术修复技术包括用于较小间隙的直接神经修复，以及用于较大间隙的神经移植物的应用。虽然损伤部位近端的轴突片段可以再生新的轴突芽，但是损伤部位远端的轴突片段通常经历沃勒(Wallerian)变性的过程。沃勒变性涉及神经元(例如无功能的远端轴突及其髓鞘)的分解和清除。人们相信轴突和髓鞘质碎片具有减少神经再生的生长抑制效果。大量的证据表明神经元的清除能够改善远端神经片段的轴突外生长(outgrowing)。神经移植物，例如具有与神经束相似的结构和组成的非细胞移植物，可以通过提供新的轴突片段可以通过其生长的支架来辅助轴突再生。神经移植物支持和引导生长的轴突片段，并且当非细胞的时候，提供没有轴突和髓鞘质碎片的通路。背根神经节(DRG)是包含用于外周神经系统的感觉神经元的感觉神经元细胞体的解剖结构。专利技术简述本专利技术提供了用于生物测定的技术和系统，所述生物测定是使用支配外周神经系统的神经元的外周神经生长的体外模拟。在一些实施方式中，该技术有助于检测神经移植物(例如，加工的、非细胞人类同种异体移植物)的生物活性或效力，以促进或支持外周神经再生。例如，通常生物测定可用于确定神经移植物的生物活性，或者用于验证或证实神经移植物的生产、储存或其他处理的一个或多个方面。在某些实施方式中，本专利技术的方法包括将神经元附着于神经移植物片段以形成测试结构；在培养基中培养测试结构；分析测试结构以评估外生长的神经结构的量；并根据分析得出的度量确定神经移植物的效力。在某些实施方式中，神经元是一组收获的神经元，例如背根神经节(DRG)或脊髓片段。在其他实施方式中，神经元可以是来源于干细胞(例如人类诱导多能干细胞(hiPSC))的神经元。在hiPSC的情况下，该测定可用于评估个体的细胞如何响应不同的因子，例如不同的药物。优选地，神经元是支配外周靶标的神经元(即外周神经神经元)。神经元可以是例如感觉神经元或运动神经元。在一个实施方式中，分析可以通过组织学处理进行(例如，固定，切片，放置在载玻片上，染色培养的神经移植物片段)，然后对载玻片进行图像分析，从而确定最远外生长神经结构的长度。在另一个实施方式中，可以通过用扩散张量成像扫描全部或部分测试结构并产生识别外生长神经结构的示踪成像图像来执行分析。然后可以通过例如测量图像上的一个或多个外周神经结构的长度来定量外生长神经结构的数量。在另一个实施方式中，从在神经元细胞中表达荧光团的荧光转基因动物获得DRG。通过用荧光显微镜扫描全部或部分测试结构并产生识别外生长外周神经结构的图像来执行分析。然后可以通过例如测量图像上的一个或多个神经结构的长度来定量外生长神经结构的数量。在一些实施方式中，分析可以包括定量测量与外生长神经结构相关的蛋白质或蛋白质的mRNA的数量。例如，许旺(Schwann)细胞或神经突可被表明它们的存在的靶蛋白(如βIII-微管蛋白)识别。通过在测试结构中溶解蛋白质(或与这些蛋白质相关的mRNA)，测定可以确定结构中蛋白质(或相关mRNA)的量。这个量与神经结构的数量有关。例如，可以使用ELISA或rtPCR测定来确定相关靶蛋白或mRNA的量。在一些实施方式中，可以使用技术和材料来测试不同测试条件对神经生长的影响。有利地是，本文描述的技术和材料可以形成具有基线生物活性的一组稳定的生物测定条件。这允许在不改变其他稳定的生物测定条件的情况下，作为待测试的研究方案的一部分，添加或改变一个条件。在另一个实施方式中，可提供具有用于测试不同测试条件对神经生长的影响的某些材料的试剂盒。提供简述是为了以简化的形式介绍将在以下专利技术详述中进一步描述的一些概念。本专利技术简述部分不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。附图说明图1A示出了描述根据本专利技术的生物测定进行的某些步骤的示例过程流程。图1B示出了包括组织的组织学处理和染色以及之后的图像分析的一个实施方式的示例方法流程。图1C示出了使用扩散张量成像的替代实施方式的示例过程流程。图1D示出了使用荧光显微镜的替代实施方式的示例过程流程。图1E示出了使用与外生长神经结构相关的靶蛋白的mRNA检测的替代实施方式的示例过程流程。图1F示出了使用与外生长神经结构相关的靶蛋白检测的替代实施方式的示例过程流程。图2示出了可用于包括测试结构的免疫组织化学分析的实验中的某些材料和相关方法的图。具体实施方式公开的技术和系统用于基于DRG的生物测定，其是使用支配外周神经系统的感觉神经元的外周神经生长的体外模拟。“生物测定”涉及使用活体动物或植物(体内)或组织或细胞(体外)来评估测试的材料和/或方法的生物活性和/或衍生物。通常进行生物测定以测量物质或方法对活体的影响。在本专利技术的一些实施方式中，该技术有助于检测神经移植物的生物活性或效力，以促进或支持外周神经再生。例如，通常生物测定可用于确定神经移植物的生物活性，或者用于验证或证实神经移植物的生产、储存或其他处理的一个或多个方面。例如，生物测定可用于在生产、加工或储存参数改变后重新确认神经移植物的生物活性。生物测定也可以用作神经移植物生产过程中的定期质量控制措施。在一些实施方式中，技术包括：将神经元附着到神经移植物片段以形成测试结构；在培养基中培养测试结构；分析测试结构以评估外生长外周神经结构的数量；并根据衍生自分析的度量确定神经移植物的效力。在某些实施方式中，神经元是一组收获的神经元，例如背根神经节(DRG)或脊髓片段。在其他实施方式中，神经元可以是来源于干细胞的神经元，例如人类诱导多能干细胞(hiPSC)。在hiPSC的情况下，该测定可用于评估个体的细胞如何响应不同的因子，例如不同的药物。优选地，神经元是支配外周靶标的神经元(即外周神经神经元)。神经元可以是例如感觉神经元或运动神经元。测试结构的分析可以几种方式进行。在一个实施方式中，分析可以通过组织学处理(例如，固定，切片，放置在载玻片上，染色培养的神经移植物片段)进行，然后对载玻片进行图像分析来确定最远外生长神经结构的长度。在另一个实施方式中，可以通过用扩散张量成像扫描全部或部分测试结构并产生识别外生长神经结构的示踪成像图像来执行分析。然后可以通过例如测量图像上的一个或多个神经结构的长度来定量外生长神经结构的数量。在另一个实施方式中，从在神经元细胞中表达荧光团的荧光转基因动物获得DRG。通过用荧光显微镜扫描全部或部分测试结构并产生识别外生长神经结构的图像来执行分析。然后可以通过例如测量图像上的一个或多个神经结构的长度来定量外生长神经结构的数量。可以定量最远外生长外周神经结构的长度。在一些实施方式中，分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于进行包含神经内膜管支架的非细胞神经移植物的生物测定的方法，支架中的神经内膜管的内表面包括层粘连蛋白，所述方法包括：/n将神经元或神经元组附着到非细胞神经移植物片段的第一端以形成测试结构；/n在培养基中培养测试结构一段时间，以允许神经从神经元或神经元组外生长到非细胞神经移植物片段中；/n根据以下至少一项对所述测试结构进行分析，以确定外生长神经结构的量：与外生长神经结构相关的一个或多个外周神经结构的长度或靶蛋白的量或用于靶蛋白的mRNA的量；和/n至少部分地基于所确定的外生长神经结构的量来确定非细胞神经移植物片段的效力。/n

【技术特征摘要】
20150528 US 14/724,3651.一种用于进行包含神经内膜管支架的非细胞神经移植物的生物测定的方法，支架中的神经内膜管的内表面包括层粘连蛋白，所述方法包括：
将神经元或神经元组附着到非细胞神经移植物片段的第一端以形成测试结构；
在培养基中培养测试结构一段时间，以允许神经从神经元或神经元组外生长到非细胞神经移植物片段中；
根据以下至少一项对所述测试结构进行分析，以确定外生长神经结构的量：与外生长神经结构相关的一个或多个外周神经结构的长度或靶蛋白的量或用于靶蛋白的mRNA的量；和
至少部分地基于所确定的外生长神经结构的量来确定非细胞神经移植物片段的效力。


2.根据权利要求1所述的方法，其中根据与外生长神经结构相关的一个或多个外周神经结构的长度以及靶蛋白的量或用于靶蛋白的mRNA的量来确定外生长神经结构的量。


3.根据权利要求1所述的方法，其中根据与外生长神经结构相关的两个或多个外周神经结构的长度来确定外生长神经结构的量。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少根据一个或多个外周神经结构的长度来确定外生长神经结构的量，并且其中对所述测试结构进行分析包括：
制备用于切片的所述测试结构；
将所述测试结构分割成多个切片，其中所述多个切片中的每一个与垂直于所述第一端的所述非细胞神经移植物片段的一侧间隔预定距离地纵向移除；和
用一种或多种染色剂染色每个切片。


5.根据权利要求4所述的方法，其中制备用于切片的所述测试结构包括固定所述测试结构和石蜡包埋所述测试结构。


6.根据权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个染色剂中的一个染色剂选自由βIII-微管蛋白、PGP9.5和S100抗体组成的组。


7.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少根据一个或多个外周神经结构的长度来确定外生长神经结构的量，并且其中，对所述测试结构进行分析包括：
用扩散张量成像扫描全部或部分测试结构并产生示踪成像图像，其中由示踪成像图像识别外生长神经结构；和
从示踪成像图像中定量外生长神经结构的量。


8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述神经元或神经元组是背根神经节（DRG）外植体。


9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中对所述测试结构进行分析包括测定以确定与所述外生长神经结构相关的靶蛋白的量。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶蛋白选自由βIII-微管蛋白、S100和GAP-43组成的组。


11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述外生长神经结构是神经突或许旺细胞。


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【专利技术属性】
技术研发人员：柯特·戴斯特，卡斯拉·塔伊达朗，
申请(专利权)人：阿克松根股份公司，
类型：发明
国别省市：美国;US