一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法，该草地贪夜蛾种特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术基于线粒体DNA COⅠ基因开发的草地贪夜蛾的种特异性引物，利用草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫和玉米螟5种鳞翅目昆虫对草地贪夜蛾的种特异性引物对进行种特异性检验，进一步建立种特异性引物与线粒体COⅠ基因通用引物的多重PCR反应体系，以COⅠ通用引物的扩增产物作为PCR反应的内对照，用于检测所检测材料中是否存在可供检测的DNA，为草地贪夜蛾的快速识别与疫情监控提供技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法
本专利技术涉及一种昆虫鉴别方法，具体涉及一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法。
技术介绍
草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda是一种世界性的重大农业害虫，作为入侵种对我国的粮食安全和生态安全构成严重威胁，因此对草地贪夜蛾进行快速准确的识别鉴定是草地贪夜蛾综合防控、保障农林业安全和生态环境安全的必要前提。国内田间调查发现草地贪夜蛾常与斜纹夜蛾Spodopteralitura、甜菜夜蛾Spodopteraexigua、粘虫Mythimnaseparata等鳞翅目昆虫混合发生，形态特征和为害特点均较为相似，经验缺乏者仅从形态上难以进行区分，同时传统的形态学鉴定方法易被虫态(如卵、幼虫、蛹)、残体、亚群、性别等影响，加大草地贪夜蛾快速准确鉴定的难度。基于目前存在的问题，亟待开发特定的分子鉴定技术，补偿传统形态学鉴定的局限，提高物种鉴定的准确性和时效性。2003年，Hebert等提出基于线粒体DNACOⅠ基因的DNA条形码(DNAbarcoding)对生物进行物种鉴定，该技术不受虫态、虫体完整性、性别等局限，且易操作实施、重复性好，已在昆虫纲的种类鉴定中得到广泛应用，包括鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等31个目。2019年，张磊等利用线粒体DNACOⅠ基因对入侵云南的草地贪夜蛾进行分子鉴定，然而该方法需要进行大量的测序、序列比对及构建系统进化树等，步骤繁琐、耗时长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法，建立种特异性引物与线粒体COⅠ基因通用引物的多重PCR反应体系，以COⅠ通用引物的扩增产物作为PCR反应的内对照，用于检测所检测材料中是否存在可供检测的DNA，为草地贪夜蛾的快速识别与疫情监控提供技术手段。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种草地贪夜蛾种特异性引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术的另一目的是提供一种用于鉴别草地贪夜蛾的种特异序列，该种特异序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的另一目的是提供一种采用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物对检测草地贪夜蛾的试剂盒。优选地，该试剂盒中还包含核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物对。本专利技术的另一目的是提供一种基于多重PCR鉴别草地贪夜蛾的方法，该方法采用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物对及核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物对进行多重PCR反应，若扩增得到349bp和750bp的扩增产物，则待测昆虫为草地贪夜蛾。优选地，该方法的多重PCR反应体系的成分包含：TaqDNAPolymerase、10×TaqBuffer、dNTPs、核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物对、核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物对、待测昆虫的DNA基因组、ddH2O。优选地，所述种特异性引物对和线粒体DNACOⅠ通用引物对的浓度比为1：2。优选地，核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物的浓度均为10μM，用量均为0.4μL；核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物的浓度均为10μM，用量均为0.8μL。优选地，多重PCR反应的退火温度Tm为56.5～59.5℃。优选地，在多重PCR反应的退火温度Tm为56.5℃时，所述待测昆虫的DNA基因组的浓度大于1.56ng/μL；在多重PCR反应的退火温度Tm为59.5℃时，所述待测昆虫的DNA基因组的浓度大于12.5ng/μL。本专利技术的草地贪夜蛾种特异性引物对及试剂盒和鉴别方法，具有以下优点：本专利技术基于线粒体DNACOⅠ基因开发草地贪夜蛾的种特异性引物，利用草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫和玉米螟5个物种对草地贪夜蛾的种特异性引物进行种特异性检验，进一步建立种特异性引物与线粒体COⅠ基因通用引物的多重PCR反应体系，以COⅠ通用引物的扩增产物作为PCR反应的内对照，用于监测所检测材料中是否存在可供检测的DNA，为草地贪夜蛾的快速识别与疫情监控提供技术手段。本专利技术的鉴别方法，仅使用种特异性引物，在56.5-62.5℃下均能在斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫和玉米螟中鉴定出草地贪夜蛾DNA。为了保证鉴定结果的可靠性，本专利技术的方法使用种特异性引物和线粒体COⅠ通用引物LCO1490/HCO2198的多重PCR反应体系来鉴定草地贪夜蛾，退火温度Tm控制在56.5～59.5℃，种特异性引物Spf-F/Spf-R和LCO1490/HCO21982对引物的比例控制在1:2左右，并且根据退火温度选择DNA用量，保证了扩增条带明显。将扩增获得的种特异性产物序列(349bp)进行同源性比对，结果显示没有同属(Spodoptera)近缘物种如斜纹夜蛾Spodopteralitura或其他蛾类昆虫的与草地贪夜蛾的该种特异性序列完全一致，表明该检测技术体系完全可以用于草地贪夜蛾的监测、口岸检疫或寄主植物等种苗和植株中的草地贪夜蛾进行快速鉴定。附图说明图1为基于通用引物LCO1490/HCO2198对5种鳞翅目昆虫线粒体DNACOⅠ序列的扩增结果。图2为本专利技术的种特异性引物PCR条件的初次优化结果。图3为本专利技术的种特异性引物PCR条件的二次优化结果。图4为本专利技术的种特异性引物和通用COⅠ引物在退火温度56.5℃的多重PCR结果。图5为本专利技术的种特异性引物和通用COⅠ引物在退火温度58.0℃的多重PCR结果。图6为本专利技术的种特异性引物和通用COⅠ引物在退火温度59.5℃的多重PCR结果。图7为本专利技术的种特异性引物和通用COⅠ引物在退火温度61.0℃的多重PCR结果。图8为本专利技术的种特异性引物和通用COⅠ引物在退火温度62.5℃的多重PCR结果。图9为本专利技术的特定多重PCR体系对不同浓度样本DNA在退火温度56.5℃的检测结果。图10为本专利技术的特定多重PCR体系对不同浓度样本DNA在退火温度59.5℃的检测结果。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实验例所使用的材料如下：1、供试虫源利用的5种昆虫具体信息见表1，样本均浸泡于无水乙醇，保存于-20℃。表1为5种昆虫的基本信息注：草地贪夜蛾：Spodopterafrugiperda；斜纹夜蛾：Spodoptera本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草地贪夜蛾种特异性引物对，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种草地贪夜蛾种特异性引物对，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


2.一种用于鉴别草地贪夜蛾的种特异序列，其特征在于，该种特异序列如SEQIDNO.5所示。


3.一种采用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物对检测草地贪夜蛾的试剂盒。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包含核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物对。


5.一种基于多重PCR鉴别草地贪夜蛾的方法，其特征在于，该方法采用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的种特异性引物对及核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的线粒体DNACOⅠ通用引物对进行多重PCR反应，若扩增得到349bp和750bp的扩增产物，则待测昆虫为草地贪夜蛾。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的多重PCR反应体系的成分包含：TaqDNAPolymerase、10×TaqBuffer、...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳碧松，王磊，张雪莲，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51