一种鉴定血痕遗留时间的方法及其mRNA组合技术

本发明专利技术提供了一种鉴定血痕遗留时间的方法，通过检测血迹中STAT3，TR1B1，HSPA1B，PER1，CDKN1A，THRA，MKNK，SPEBF1，ACTB的相对表达量推测血痕遗留时间；所述的相对表达量以mRNA ACTB作为内参使用2

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定血痕遗留时间的方法及其mRNA组合
本专利技术属于法医学检测领域，具体涉及一种推断血痕遗留时间的方法及其mRNA组合。
技术介绍
刑事侦查中，除对常规的指纹、足迹、DNA等痕迹提取检验以及对血痕的基本形态、色泽、厚度、分布形态等记录检验外，对现场痕迹(包括血痕、笔迹、汗液指纹等)遗留时间的正确鉴别判断有助于客观反映案发时刻现场人员的活动状况，也会成为证实案发时间的有力依据。其中血痕的遗留时间鉴定对案件发生时间的推定有十分重要的参考价值。血痕时间的鉴定方法的研究主要集中于根据DNA或RNA在体外的降解程度来推测痕迹的遗留时间，这种方法受环境因素影响较大，并且对DNA或RNA的降解的检测需要的时间较长，容易增加时间推测误差。目前仍缺少有效的手段避免前述两个问题。昼夜节律是一种内源性变化，周期约为24小时，支配着包括人类在内的大多数生物的日常生活。这些内在的节律变化是由一组核心时钟基因形成的自动调节负反馈回路产生的。已经有研究表明，大约3-10％的mRNA在各个组织中的表达呈现出周期性变化。一些研究中采用竞争性RT-PCR法定量检测不同时点视交叉上核中褪黑素受体基因的mRNA表达，结果显示表明两种褪黑素受体亚型mRNA的表达都具有昼夜节律性，但节律参数不同[1]。目前尚无利用mRNA的节律性进行血痕遗留时间鉴定从而应用于刑侦检测中。杜玉珍,童建.视交叉上核中褪黑素受体mRNA的昼夜节律性表达[C]//环境与职业医学研究生联谊会学术研讨会.2002.
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术根据昼夜节律基因在24h内的差异表达，选择8个节律基因，并使用机器学习的方法构建预测模型，相比其他方法可以更加精确地推断血痕的离体时间(遗留时间)对血痕遗留时间进行推测，改善了现有血痕遗留时间推测的误差大和不稳定等缺点。一方面，本专利技术提供了一种鉴定血痕遗留时间的mRNA组合。所述的mRNA组合包括：STAT3，TR1B1，HSPA1B，PER1，CDKN1A，THRA，MKNK，SPEBF1。所述的mRNA组合中还包括内参基因ACTB。另一方面，本专利技术提供了一种鉴定血痕遗留时间的方法。通过检测前述的mRNA组合中各个mRNA的相对表达量推测血痕遗留时间进行鉴定；所述的相对表达量以mRNAACTB作为内参使用2-△△CT法进行计算。通过KNN模型进行血痕遗留时间鉴定模型的构建。优选地，所述的方法包括以下步骤：(1)提取样本RNA；(2)样本RNA逆转录为cDNA；(3)以cDNA为模板，设计前述mRNA组合中各个mRNA的扩增引物并分别进行扩增；(4)以mRNAACTB作为内参使用2-△△CT法进行相对表达量的计算；(5)使用Orange:DataMiningToolboxinPython中的KNN模型根据步骤(4)计算出的相对表达量进行血痕遗留时间进行预测。再一方面，本专利技术提供了前述的mRNA组合在制备鉴定血痕遗留时间的试剂和/或试剂盒中的应用。又一方面，本专利技术提供了一种鉴定血痕遗留时间的试剂盒。所述的试剂盒中包括用于检测前述的mRNA组合中各个mRNA表达量的检测试剂。所述的检测试剂包括用于扩增前述的mRNA组合中各个mRNA的正反向引物。优选地，所述的正反向引物如下：所述的试剂盒中还包括酶、缓冲液。所述的酶包括但不限于：DNAPolymerase、25×RT-PCREnzymeMix、AntiTaqDNA聚合酶。所述的缓冲液包括但不限于：镁离子、dNTP、lowROX。又一方面，本专利技术提供了前述试剂盒的使用方法。具体地，包括以下步骤：1、提取样本RNA；2、样本RNA逆转录为cDNA；3、根据前述正反向引物分别进行mRNA的扩增；4、以mRNAACTB作为内参使用2-△△CT法进行相对表达量的计算；5、使用Orange:DataMiningToolboxinPython中的KNN模型根据步骤4计算出的相对表达量进行血痕遗留时间进行预测。本专利技术的有益效果：1、对血迹样本即时检测，受环境影响较小；2、对血迹样本直接进行检测，检测时间短，结果误差更小。附图说明图1为mRNACDKN1A的qPCR反应条件的优化结果。图2为mRNATR1B1的qPCR反应条件的优化结果。图3为mRNAHSPA1B的qPCR反应条件的优化结果。图4为mRNAPER1的qPCR反应条件的优化结果。图5为mRNAMKNK的qPCR反应条件的优化结果。图6为mRNACDKNA的qPCR反应条件的优化结果。图7为mRNATHRA的qPCR反应条件的优化结果。图8为mRNASREBF1的qPCR反应条件的优化结果。图9为mRNAHSPA1B的qPCR反应条件的优化结果。图10为不同时间点mRNAPER1的表达情况。图11为不同时间点mRNAMKNK的表达情况。图12为不同时间点mRNAHSPA1B的表达情况。图13为不同时间点mRNATHRA的表达情况。图14为不同时间点mRNASREBF1的表达情况。图15为不同时间点mRNASTAT3的表达情况。图16为不同时间点mRNACDKN1A的表达情况。图17为不同时间点mRNATRIB1的表达情况。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本专利技术，仅用于说明本专利技术。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种推断血痕遗留时间的方法按以下步骤操作：1、样本收集使用无菌1mL注射器采集来自山西地区的6名无关志愿者个体(年龄在20-30周岁，编号ID1-6)的手臂处静脉血样本共计48份，分别为：11份血液样本为凌晨3:00采集，12份血液样本为早晨9:00采集，12份血液样本为15:00采集，13份血液样本为21:00采集(详细样本情况见表1)。将收集的血液样本各取200μL置于无菌棉签，在阴暗通风处晾干。将晾干后的棉签进行-80℃储存。表1样本收集情况注：表中所展示的是在不同日期不同时间点的6名无关个体的血液样本收集情况，其中时间点后的编号为样本标号(1-48)，例如表中下划线处21:00-2，为无关个体ID2在2月16日21:00所收集的样本，其样本编号为2。2、RNA提取和逆转录使用RNAisoPlus(TotalRNA提取试剂，品牌Takara)氯仿和异丙醇分别提取48份带有血痕的棉签的总RNA，使用200PR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定血痕遗留时间的mRNA组合，其特征在于，包括：STAT3，TR1B1，HSPA1B，PER1，CDKN1A，THRA，MKNK，SPEBF1。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定血痕遗留时间的mRNA组合，其特征在于，包括：STAT3，TR1B1，HSPA1B，PER1，CDKN1A，THRA，MKNK，SPEBF1。


2.根据权利要求1所述的mRNA组合，其特征在于，所述的mRNA组合中还包括内参基因ACTB。


3.一种鉴定血痕遗留时间的方法，其特征在于，通过检测权利要求1-2任一项所述的mRNA组合中各个mRNA的相对表达量推测血痕遗留时间进行鉴定；所述的相对表达量以mRNAACTB作为内参使用2-△△CT法进行计算。


4.根据权利要求3所述的鉴定血痕遗留时间的方法，其特征在于，通过KNN模型进行血痕遗留时间鉴定模型的构建。


5.权利要求1-2任一项所述的mRNA组合在制备鉴定血痕遗留时间的试剂和/或试剂盒中的应用。


6.一种鉴定血痕遗留时间的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括用于检测权利要求1-2任一项所述的mRNA表达量的检测试剂。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包括用于扩增权利要求1-2任一项所述的mRNA的正反向引物。


8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增权利要求1-2任一项所述的mRNA的正反向引物如下：











目的片段长度bp
正向扩增引物
反向扩增引物


ACTB
161
SEQIDNO.1
SEQIDNO.2

【专利技术属性】
技术研发人员：严江伟，程凤，李万婷，漆小琴，张晓梦，李娜，党丽虹，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西;14