一种基于高通量测序的鲑科鱼制品中动物源成分鉴别方法技术

本发明专利技术涉及食品质量安全检测技术领域，具体公开了一种基于高通量测序技术的鲑科鱼及其制品中动物源性成分鉴别方法，包括提取基因组DNA，用带有碱基标签的扩增长度为255 bp的

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序的鲑科鱼制品中动物源成分鉴别方法
本专利技术属于食品质量安全检测
，具体而言，本专利技术涉及一种基于高通量测序的鲑科鱼制品中动物源性成分鉴别方法。
技术介绍
鲑科(Salmonidae)隶属于脊索动物门(Chordata)鲑形目(Salmoniformes)，共包括3个亚科(鲑亚科、白鲑亚科和茴鱼亚科)、7个属(大马哈属、红点鲑属、哲罗鲑属、细鳞鲑属、鲑属、白鲑属和茴鱼属)，共约220种鱼。鲑科鱼是一类具有营养价值和保健功效的深海鱼类，味道鲜美可口，深受广大消费者喜爱。目前国际与国内最常见的动物制品掺假筛查相关的核酸检测技术是利用Sanger测序法，PCR（荧光定量PCR）方法，结合电泳（或酶切）等技术进行检测。但是现行方法通常一次只能检测出一种或者少数几种物种，无法实现未知样品中多种源性成分的同步鉴别。当样本数量很大时，需要花费很大的物力和人力。另外，当待测样品是混合物或者未知样品时，生物体的分离比较困难，这些现有的动物制品掺假鉴别技术，无论从涉及的产品范围，还是从方法的适用性等方面，都远远无法满足现实的需求。特别是随着现代工业的发展，鲑科鱼制品的种类越来越多，加工越来越精细，成分越来越复杂，物种的原始特征已经消失，导致掺假隐蔽，难以检测。因此，同时对多物种进行非定向筛查的需求越来越大。而高通量测序技术的出现极大地提高了DNA的分析效率，改变了传统的分析模式，通过选择一段合适扩增区间和长度的通用引物，可以一次性地检测出混合样品中的全部物种。本专利技术提供了一种利用高通量测序技术对鲑科鱼混合制品中的动物源性成分进行鉴别的方法。以期为市售鲑科鱼商品的种类鉴别和成分检测等提供理论依据和技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种基于高通量测序技术的鲑科鱼制品中动物源性成分鉴别方法，可准确且高效的检测出样品中存在的全部动物源性物种成分，具有检测范围广、检测通量高、灵敏度高等优点。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现:（a）从待测样品中提取基因组DNA；（b）用带有上下游标记的16SrRNA通用引物对（a）中所述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；（c）对所述PCR扩增产物进行纯化、测定浓度；（d）用上一步骤中达到浓度要求的PCR扩增产物构建测序文库并进行质量检验；（e）对上一步测序文库进行高通量测序，获得16SrRNA基因片段序列；（f）将上一步所得16SrRNA基因片段序列与公共数据库进行比对，根据测序序列与数据库中已知序列的同源性确定鲑科鱼制品中的动物源性物种成分。本专利技术所述鲑科鱼制品包括鲑科鱼、鲑科鱼加工品以及包含鲑科鱼成分的食品。步骤（b）中，为了在后续生物信息学分析中将不同样品的扩增序列进行区分，在上、下游引物的3’端前添加不同的标记序列，用于标识不同的DNA模板，便于将不同样品混合测序。步骤（b）中，16SrRNA基因扩增的正反向引物分别16SF：AYAAGACGAGAAGACCC和16SR：GATTGCGCTGTTATTCC，具体反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸60s，35个循环，最后72°C延伸10min。步骤（c）中，对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。所述（d）中包括以下步骤：PCR产物DNA末端修复、DNA片段选择、3’端加A尾、加接头桥式扩增和纯化，利用Bioanalyser2100毛细管电泳仪和Qubit®3.0进行测序文库的质量检验。步骤（e）中，本专利技术所述高通量测序采用基于Illumina第二代高通测序仪HiSeq2500PE250进行。步骤（f）中，若待测鲑科鱼制品扩增所得16SrRNA基因片段某条测序序列与公共数据库中某一动物的某条序列一致性大于等于97%，则所述待测鲑科鱼制品含有该条序列在数据库中所对应的动物物种;若待测鲑科鱼制品扩增所得16SrRNA基因片段某条测序序列与公共数据库中某一动物的某条序列一致性小于97%，则所述待测鲑科鱼制品中不含有或候选不含有该条序列在数据库中所对应的动物物种。步骤（f）中生物信息学分析中分类学单元聚类（OTU）的阈值为97%；只有在至少2个重复中均检测到该物种时，才认为该物种存在于样品中；对于标签中未标注的物种，当物种相对丰度高于2%时，才认为存在于样品中。与现有方法相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：现行的分子生物学检测方法大多无法实现未知样品中多种源性成分的同步快速鉴别，一个反应孔只能进行一种源性成分的检测。本方法基于高通量测序的研究思路，利用扩增子测序的方法，通过对长度仅为255bp的短基因片段进行扩增，可以克服由于DNA降解导致的PCR扩增效率低或者无法扩增的问题，从而可以非特异性地将鲑科鱼制品中的所有主要动物源性物种成分及杂质物种成分都检测出来，可简化流程并降低成本。附图说明图1是基于16SrRNA序列的已知混合物物种成分相对丰度柱形图。M1-M18分别与下表1中的M1-M18对应。物种丰度是指某一样品中包含的各物种数目的多少，即代表该物种的条形码序列占该样品中全部序列的比值，以百分数形式表示。通过该图可直观看出各样品的物种组成及相对含量。具体实施方式通过实施例的方式对本专利技术作进一步的说明，但是这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂和生物制剂，均为市售产品。实施例1本实施例为通过如下试验对高通量测序技术在混合物种鉴别方面的准确度和灵敏度进行评价。1.鲑科鱼混合样品的制备将各样品置于冷冻干燥机中脱水干燥后研磨成粉末，以样品质量为基准，按照不同比例和方式（鱼物种混合和鱼畜禽混合）对收集的已知来源和种属的9种鱼样品进行梯度混掺以制备混合样品（表1）。同时设置最低为1%的样品混合比，以评估高通量测序技术在物种定性方面的准确度及检测通量和灵敏度。表1鲑科鱼混合样品制备方案2.样品基因组DNA提取选用改进的CTAB法提取18份鲑科鱼混合样品的基因组DNA。分别称取各混合样品100mg，加入500µLCTAB提取液（1.2%w/vCTAB，10mMEDTA-Na，60MmTris，0.8MNacl，pH=8）和25µL蛋白酶K（10mg/mL）。将混合液于65℃裂解消化24h后12000rpm离心10min。取上清于新的1.5mL离心管中，加入500µL氯仿萃取后12000rpm离心5min。取上清，加入二倍体积CTAB沉淀缓冲液（1%w/vCTAB，10mMEDTA-Na，50MmTris，0.8MNaCl，pH=8），混合均匀于后12000rpm离心10min。弃去上清，向沉淀中加入400µLCTAB缓冲液（1mMEDTA-Na，10MmTris，1MNaCl，pH=8）后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用高通量测序技术鉴别鲑科鱼制品中动物源性物种成分的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a) 从待测样品中提取基因组DNA；/n(b) 用带有上下游标记的

【技术特征摘要】
1.一种利用高通量测序技术鉴别鲑科鱼制品中动物源性物种成分的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)从待测样品中提取基因组DNA；
(b)用带有上下游标记的16SrRNA通用引物对（a）中所述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(c)对所述PCR扩增产物进行纯化、测定浓度；
(d)用上一步骤中达到浓度要求的PCR扩增产物构建测序文库并进行质量检验；
(e)对上一步测序文库进行高通量测序，获得16SrRNA基因片段序列；
(f)将上一步所得16SrRNA基因片段序列与公共数据库进行比对，根据测序序列与数据库中已知序列的同源性确定鲑科鱼制品中的动物源性物种成分；
其中，在步骤（f）中，若待测鲑科鱼制品扩增所得16SrRNA基因片段某条测序序列与公共数据库中某一动物的某条序列一致性大于等于97%，则所述待测鲑科鱼制品含...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，邢冉冉，王楠，张九凯，于宁，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11