云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用制造技术

本发明专利技术公开了云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用。本发明专利技术具体地公开了包含编码氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)的新的四氢嘧啶生物合成基因簇，并以大肠杆菌为底盘细胞，将三个基因整合到pBAD/HisA载体中，构建出了高产四氢嘧啶的基因工程菌，通过优化发酵条件、诱导剂浓度等增强基因表达量，从原料天冬氨酸钠出发进行生物转化，增加四氢嘧啶的生物合成，本发明专利技术的高产四氢嘧啶的基因工程菌发酵罐培养72h的产量可达10.02g/L，该产量已达到国际先进水平。

【技术实现步骤摘要】
云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用
本专利技术属于基因工程
，涉及云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用，具体涉及云南腾冲来源的类芽孢杆菌四氢嘧啶合成基因簇、重组表达载体、高产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌及其应用。
技术介绍
四氢嘧啶又名四氢甲基嘧啶羧酸(Ectoine，C6H10N2O2)，是一种广泛存在于嗜盐菌中参与渗透压调节的杂环氨基酸衍生物。作为一种相容性小分子，四氢嘧啶在极端环境中扮演着保护者的角色，对生物体内的蛋白质活性、核酸构象、微环境稳态的维持均有着积极的作用。四氢嘧啶作为一种功能强大的保护剂，通过稳定和保护细胞而减少外界因素对细胞的破坏性影响，这种保护机制能够保护皮肤免受各种消极因素，包括干燥，空气污染，紫外线和可见光辐射的影响，从而实现抗衰老的功效。此外，四氢嘧啶对正常细胞也有积极作用，当使用四氢嘧啶时，细胞的功能也会得到增强。研究表明，四氢嘧啶可恢复和稳定角质层屏障功能，从而依据其科学的防护和抗炎功效而增加皮肤含水量。四氢嘧啶还表现出全方位和多层次的抗污染功效，能够抑制和减少各种空气污染成分：包括PAHs，重金属，二氧化氮以及大多数颗粒物质对皮肤和皮肤细胞的伤害。四氢嘧啶已被批准用于慢性阻塞性肺病的治疗和预防使用，用于治疗和预防COPD和哮喘等。近年来发现，四氢嘧啶对变态反应性疾病有一定缓解作用。另外，四氢嘧啶还可以抑制类淀粉蛋白的形成，能够降低类淀粉蛋白形成的起始和伸长阶段，具有潜在的预防老年痴呆症的功能。总之，四氢嘧啶是多功能、安全的活性成分，其功效已经通过临床验证，因此被广泛应用在医疗健康、生物制剂、化妆美容、制药等领域中，具有重要的开发和应用价值。由于四氢嘧啶分子中具有一个手性碳原子，因此很难用化学方法合成，目前四氢嘧啶的主要生产方式为微生物催化法和生物合成方法。微生物催化法即传统的微生物发酵方式，如采用延长盐单胞菌(Halomonaselongate)菌株发酵，在发酵过程中通过改变盐浓度来刺激菌体积累更多的产物，或者利用“细菌挤奶”原理实现四氢嘧啶的合成和分泌。但这些传统方法生产四氢嘧啶，受限于菌株本身合成能力，产量有限，同时生产所需要的高盐环境对生产设备腐蚀伤害极大，生产成本极高，不适合大规模的工业化生产。采用生物合成法生产四氢嘧啶是近年来的发展趋势，通过基因工程技术选育高产优良菌株，开发一种高效的四氢嘧啶生产方法，提高四氢嘧啶的产量，从而降低其生产成本，具有重要的经济价值和社会意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新颖的四氢嘧啶生物合成基因和基因簇，以及利用该基因簇构建的高产四氢嘧啶的菌株。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了核酸分子，名称为NEctABC，所述核酸分子编码名称分别为EctA、EctB和EctC的三种蛋白质；所述EctA为下述任一种蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；A2)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；所述EctB为下述任一种蛋白质：B1)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；B2)将SEQIDNo.2的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；B4)在B1)或B2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；所述EctC为下述任一种蛋白质：C1)氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质；C2)将SEQIDNo.3的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；C3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；C4)在C1)或C2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。进一步地，所述核酸分子可为DNA分子。进一步地，所述DNA分子可为四氢嘧啶生物合成基因簇。所述基因簇包含SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的DNA分子。所述氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质为氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)；所述氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质为二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)；所述氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质为四氢嘧啶合成酶(EctC)。A3)、B3)、C3)所述标签如表1所示：表1：标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLA4)、B4)、C4)所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。上述A2)、B2)、C2)中蛋白质可分别为与SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述A2)、B2)、C2)中的蛋白质的编码核苷酸可分别通过将SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述核酸分子中，所述核酸分子NEctABC可由SEQIDNo.4所示的DNA、SEQIDNo.5所示的DNA和SEQIDNo.6所示的DNA连接而成的DNA分子。上述核酸分子中：SEQIDNo.4所示的DNA分子编码SEQIDNo.1所示的EctA蛋白质；SEQIDNo.5所示的DNA分子编码SEQIDNo.2所示的EctB蛋白质；SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码名称分别为EctA、EctB和EctC的三种蛋白质；/n所述EctA为下述任一种蛋白质：/nA1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；/nA2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；/nA3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nA4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；/n所述EctB为下述任一种蛋白质：/nB1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；/nB2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；/nB3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nB4)在B1)或B2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；/n所述EctC为下述任一种蛋白质：/nC1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；/nC2)将SEQ ID No.3的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；/nC3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nC4)在C1)或C2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物。/n...

【技术特征摘要】
1.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码名称分别为EctA、EctB和EctC的三种蛋白质；
所述EctA为下述任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；
A2)将SEQIDNo.1的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；
所述EctB为下述任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；
B2)将SEQIDNo.2的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
B4)在B1)或B2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物；
所述EctC为下述任一种蛋白质：
C1)氨基酸序列是SEQIDNo.3的蛋白质；
C2)将SEQIDNo.3的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
C4)在C1)或C2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的蛋白质衍生物。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA分子。


3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是由SEQIDNo.4所示的DNA、SEQIDNo.5所示的DNA和SEQIDNo.6所示的DNA连接而成的DNA分子。


4.根据权利要求1、2或3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是下述任一种DNA分子：
D1)核苷酸序列是S...

【专利技术属性】
技术研发人员：董亮，张山，张岩峰，魏焘，马骁，王飞飞，苏温柔，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44