一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。本发明专利技术的大豆DGAT基因的编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术的编辑位点能被sgRNA介导的Cas9核酸内切酶靶向识别并实现基因组DNA的双链断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。本发明专利技术提供的DGAT2基因外显子的编辑位点，为对该基因进行外显子编辑提供了有效的靶标，创制不同的等位基因突变体，为调节DGAT2的表达量以改变大豆的油脂成分提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆甘油二酯提供了可靠的手段和素材。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。
技术介绍
为了保护自身免受外源遗传物质(如噬菌体、质粒)的侵袭，细菌和古细菌进化出了一种RNA分子介导的获得性免疫系统，称为CRISPR(Mojica,etal.)。2013年，研究者利用化脓性链球菌的Cas9蛋白首次在哺乳动物细胞中实现了RNA引导下的精确靶向和基因组序列修饰，为CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因组编辑工具奠定了基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统(Maetal.,2016)，在该系统中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。由于油脂积累的过程是一个复杂多样的过程，油脂的生物合成过程中引起油脂积累变化的基因有很多，主要的转录因子有WRINKLED1、LEAFYCOTY-LEDON1、LEAFYCOTY-LEDON2、FUSCA3、ABSCISSICAC-IDINSENSITIVE3、DOF4、DOF11等(Focksetal，1998；Pelletieretal，2017；Mendozaetal，2005；Wangetal，2007)，WRINKLED1能够调控糖酵解过程及脂肪酸的合成，突变体在大豆中表现出种皮皱缩，蔗糖、葡萄糖及油脂含量降低，LEAFYCOTY-LEDON1是脂肪酸合成的关键调节基因，该基因的表达能够提高有关糖酵解放映和脂肪酸酸合成的相关基因的表达，LEAFYCOTY-LEDON2的表达主要依靠WRINKLED1的表达，对糖酵解反应，油脂的生物合成及生物素合成进行调控。与油脂合成相关的酶基因主要有DGAT、FAD、KAS等，在油菜和玉米中有证明过DGAT的过表达能够提高玉米油菜中的油脂含量(Lardizabaetal，2008)，脂肪酸脱氢酶(FAD)能够催化油酸脱氢形成亚油酸，在棉花，油菜和大豆中都已证明抑制酶的作用能够提高油酸的含量(边妙等，2018)。现在主要发现的DGAT家族包括：DGAT1，DGAT2，WS/DGAT，可溶性的DGAT，在大豆中主要发现的是DGAT1和DGAT2两种基因家族。目前发现的存在于植物中的DGAT基因主要是DGAT1、DGAT2和DGAT3，其中DGAT3仅在花生中发现，其他作物中目前为止未发现，DGAT2主要存在于动植物及酵母中，DGAT1存在于动植物中，通过研究证明，在抑制DGAT1的表达后，在烟草，油菜、棉花(张飞等，2018)的油脂积累都有所减少。在花生、烟草中过表达DGAT1能够提高油脂(郑玲，2018)，并且在续随子、大豆、牡丹中对油脂的调控有重要作用(任鹏国等，2019；袁秀云等，2019)。目前就DGAT基因有关的研究可以了解到，高表达DGAT1基因对于亚麻荠种子的油脂提升9％-14％(苑丽霞等，2015)，对大豆提高5.1％(张飞等，2018)。拟南芥由甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，EMS)诱导培养拟南芥哥伦比亚生态型发生点突变从而得到的as11突变体，ass11突变体中由于DGAT基因被抑制导致甘油三酯合成速率减慢，引起甘油二酯(DAG)的积累，使DAG含量明显提高，与野生型进行比较可以提高10％左右。目前制备1,3-DAG的方法分为化学制备和酶制备两种方法，化学制备法利用特定的底物和催化剂能够制得纯度更高的1,3-DAG，酶制备1,3-DAG反应条件温和，选择性高且副反应少，环境污染少。油脂在人类的生产生活中扮演着重要的角色，对植物油脂的需求也越来越大，这极大地促进了分子生物学的研究。甘油三酯(TAG)能够为人体提供能量贮存能量，但同时，减少TAG同样可以为糖尿病患者，高血脂患者提供很大的帮助，而植物TAG合成是一个极其复杂的过程，涉及大量的基因及其编码的酶类，改变其中任何一个关键酶，都有可能改变植物含油量或者油酸成分，所以弄清合成过程中的每一个环节具有重大意义。近年来，利用基因工程技术手段改造植物油脂生物合成与代谢途径中相关基因取得了较大的进展，TAG合成途径越来越清晰，与植物脂肪酸和TAG合成相关的基因多态性位点不断被发现，因此研究种子特异性表达DGAT基因对种子总含油量及各主要脂肪酸含量、蛋白含量的影响有助于我们更深层次的了解认识油脂代谢的网络系统，能够为以后增加油脂产量，提高油脂质量提供巨大的帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。本专利技术提供的大豆DGAT2(二酰甘油酰基转移酶)基因的编辑位点，可用于Cas9介导的打靶，对DGAT2基因的启动子进行编辑，创制不同的等位基因突变体。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种大豆DGAT2基因外显子的编辑位点作为编辑DGAT基因的靶标的用途，所述大豆DGAT基因的编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。作为本专利技术所述用途的优选实施方式，所述大豆DGAT基因的编辑位点在大豆基因组的准确定位是09号染色体DGAT2基因的1号外显子，染色体的坐标为41998907-42006064，位于DGAT2基因53-76处。作为本专利技术所述用途的优选实施方式，所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点3’端含有AGG，所述编辑DGAT基因为利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。作为本专利技术所述用途的优选实施方式，所述sgRNA的序列如SEQIDNO：2所示，为GGAGGGGGAGAAGGTGTTCA。作为本专利技术所述用途的优选实施方式，具体包括以下步骤：(1)构建含有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点的Cas9sgRNA表达载体；(2)将上述表达载体转化至发根农杆菌K599中，并侵染大豆子叶；(3)除草剂加压筛选转基因系；(4)PCR鉴定Cas9基因，测序验证靶点序列编辑情况。作为本专利技术所述用途的优选实施方式，所述表达载体为以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架构建插入有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点序列的Cas9sgRNA表达载体。本专利技术以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架构建插入有DGAT2基因编辑靶位点的Cas9sgRNA表达载体YC2，将其转化至发根农杆菌K599中，侵染大豆子叶节。表达载体中含有除草剂抗性基因，可以使用除草剂筛选转基因系，随后对含有除草剂抗性的转基因系进行Cas9基因鉴定，然后对含有C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆DGAT2基因外显子的编辑位点作为编辑DGAT基因的靶标的用途，其特征在于，所述大豆DGAT基因的编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种大豆DGAT2基因外显子的编辑位点作为编辑DGAT基因的靶标的用途，其特征在于，所述大豆DGAT基因的编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大豆DGAT基因的编辑位点在大豆基因组的准确定位是09号染色体DGAT2基因的1号外显子，染色体的坐标为41998907-42006064。


3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点3’端含有AGG，所述编辑DGAT基因为利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔凡江，杨涔，陈丽玉，廖春梅，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：广东;44