一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统技术方案

本发明专利技术公开了一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号根据荧光波长分成多路信号，通过单光子探测器探测，将信号传输至信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线，本系统实现了荧光三元相关光谱通过对检测微区内三种发射出不同波长的荧光分子荧光波动信号进行实时记录和三元相关函数分析获得荧光三元相关光谱曲线，解析曲线的振幅与三种荧光分子复合物浓度的关系，实现三种不同分子间共同结合作用的分析，将拓展荧光相关光谱在活细胞内原位分析研究。

【技术实现步骤摘要】
一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统
本专利技术涉及一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，属于光谱分析领域。
技术介绍
显微成像和光谱分析技术由于具有的非侵入性、高检测灵敏度等优势成为目前生命科学研究中重要的研究工具，如光活化定位显微镜技术、随机光学重构显微镜技术等。细胞内不同生物分子间通过不断的两两相互作用和三元相互作用等，进行电子转移、信号传导、功能调控等，实现细胞的生理功能。细胞内异常的分子间相互作用的发生，如多蛋白的聚集作用是很多疾病发生的基础，如克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)，并可能导致癌症。目前发展的很多技术，包括酵母双杂交法、亲和纯化-质谱分析法、免疫共沉淀法、蛋白质微阵列、超速离心分析法、表面等离子体共振分析和量热法等可以实现对分子间相互作用的离线分析。但这些方法无法实现对活细胞内分子间作用进行原位分析。荧光相关光谱是一类具有超高灵敏度的单分子光学检测方法，是目前进行活细胞原位分析的重要工具，包括荧光自相关光谱(FACS)和荧光互相关光谱(FCCS)等。荧光自相关光谱系统通过对检测微区(<1fL)内的荧光分子由于布朗运动或者化学反应造成的荧光信号的涨落进行记录，然后对荧光涨落信号进行自相关函数(Autocorrelationfunction，ACF)分析，得到荧光分子的荧光自相关光谱曲线，获取其浓度、扩散系数、化学反应速率常数、结合和解离常数等信息。由于FACS作为一种单分子光学分析技术，具有非侵入性、灵敏度高、空间分辨率高等特点，因此被广泛应用于在活细胞内进行测定。荧光自相关光谱通过测定荧光分子或者荧光分子标记的生物分子的扩散系数的变化分析荧光分子或者荧光分子标记生物分子与其它分子间发生的结合作用。由于分子的扩散速率一般与分子的质量的立方根成反比，因此扩散系数的显著变化必须要求荧光分子与其它分子结合后存在质量的非常显著差异。同时，由于细胞内复杂的不均匀性、高拥挤性等特点，严重限制了荧光自相关光谱在活细胞内分子间相互作用的研究。与荧光自相关光谱系统不同，荧光互相关光谱系统一般采用两束同轴的激光束作为激发源，采用分光光路构建了两个针对不同波长的荧光信号的检测通道。通过对从两个通道的荧光波动信号进行互相关函数(Cross-correlationfunction，CCF)分析，获得荧光互相关光谱曲线。荧光互相关光谱常用于运动中的两种不同的荧光分子间的相互作用分析。当两种标记不同荧光发射波长的基团的分子由于布朗运动并发生结合作用时，那么两个通道荧光信号的涨落呈现出同步性，在荧光互相关光谱分析中可获得荧光互相关光谱曲线。发生相互作用的分子比例越高，荧光互相关光谱的振幅G(0)值越大。对比于荧光自相关光谱，荧光互相关光谱对相互结合的两分子间分子量差异没有要求，因此显著增加了对分子间相互作用分析的适用性，因此它已成为活细胞内研究分子间相互作用的重要工具之一。然而，在复杂的生命体系如细胞中很多生物功能的表达需要三种及三种以上生物分子间发生共同结合作用。荧光互相关光谱虽然可以实现分子间两两相互作用研究，但无法实现三种生物分子间共同结合作用的研究。
技术实现思路
本专利技术的研究目的是提供一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，该系统可实现三种不同荧光团标记的分子间结合作用的实时原位分析，突破传统的荧光相关光谱无法用于三种分子间结合作用实时解析的限制。本专利技术提供的荧光三元相关光谱系统中，激发光源同轴发射的激光束经准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头、筒镜后进入物镜，用于照明样品。照明样品激发产生的荧光信号经同一物镜收集，穿过同一筒镜、扫描镜头、扫描振镜和二色镜后，经聚焦透镜聚焦，并由三组二色镜将荧光信号根据荧光波长分成四路信号，分别经聚光透镜汇聚后进入多模光纤传导至单光子探测器，进行信号探测。信号传输至与四个单光子探测器相连的信号采集卡，实时采集四路信号数据，并进行任意三路信号间的三元相关光谱实时运算。所述荧光三元相关光谱系统的激发光源分别由四个激光器、至少三个二色镜和至多一根单模光纤组成，激光器输出的四条激光束被调至从同一根单模光纤输出。所述荧光三元相关光谱系统中单模光纤输出激光束进入物镜激发样品之前，经过准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头和筒镜实现光学整形。所述荧光三元相关光谱系统中，在多个二色镜之间设置聚光透镜，以调整荧光信号的聚焦和荧光检测光路的对准。所述荧光三元相关光谱系统中，在聚光透镜汇聚荧光信号进入光纤头前，聚光透镜和四个单光子探测器之间设置有至少三个二色镜，使样品的荧光信号按照光谱波长分成四个检测光路。所述荧光三元相关光谱系统中，每条检测光路的荧光信号被聚光透镜汇聚到一个光纤头，再经多模光纤传输到单光子探测器，以实现共焦检测。所述荧光三元相关光谱系统中，每个光纤头架在一个机械三维光学调整架上，用以实现单光子探测器对荧光信号的高效收集。所述荧光三元相关光谱系统中，通过信号采集和运算卡实时运算出三元相关光谱曲线。本专利技术提供的荧光三元相关光谱系统具有以下有益效果：1、实现了不同激光束经同一单模光纤传导和物镜聚焦形成的光斑重合，提高了三元相关光谱的振幅；2、实现了不同激光束经同一单模光纤传导和物镜聚焦形成的检测体积同时都小于1毫微微升(fL)；3、实现了对三路荧光波动信号的三元相关函数的在线实时运算；4、实现了对具有四种不同荧光发射光谱的粒子的荧光相关光谱分析，增加了可分析的荧光分子种类数目；5.本系统实现了荧光三元相关光谱通过对检测微区(<1fL)内三种发射出不同波长的荧光分子荧光波动信号进行实时记录和三元相关函数分析(Triple-correlationfunction，TCF)，获得荧光三元相关光谱曲线，解析曲线的振幅与三种荧光分子复合物浓度的关系，从而实现三种不同分子间共同结合作用的分析，荧光三元相关光谱将拓展荧光相关光谱在活细胞内原位分析研究。附图说明图1为本专利技术提供的荧光三元相关光谱系统的结构示意图；图中各标记如下：第一固体激光器1、第二固体激光器2、第三固体激光器3、第四固体激光器4、第一二色镜501、第二二色镜502、第三二色镜503、单模光纤6、准直扩束镜7、第四二色镜8、扫描振镜9、扫描镜头10、筒镜11、第一反射镜1201、第二反射镜1202、第三反射镜1203、第四反射镜1204、第五反射镜1205、第六反射镜1206、物镜13、样品14、第一聚光透镜15、第五二色镜16、第六二色镜17、第七二色镜18、第一带通滤光片19、第二聚光透镜20、第一光纤头21、第一多模光纤22、第一单光子探测器23、第二带通滤光片24、第三聚光透镜25、第二光纤头26、第二多模光纤27、第二单光子探测器28、第三带通滤光片29、第四聚光透镜30、第三光纤头31、第三多模光纤32、第三单光子探测器33、第四带通滤光片34、第五聚光透镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，其特征在于：所述荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源同轴发射的激光束照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号由多组二色镜根据荧光波长分成多路信号，分别传导至对应的单光子探测器进行信号探测，信号传输至与对应单光子探测器相连的信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，其特征在于：所述荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源同轴发射的激光束照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号由多组二色镜根据荧光波长分成多路信号，分别传导至对应的单光子探测器进行信号探测，信号传输至与对应单光子探测器相连的信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线。


2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述激发光源包括多个激光器，激光器经二色镜或反射镜处理后通过准直耦合器从同一根单模光纤输出。


3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：激发光源发射的激光束依次经过准直扩束镜、二色镜、扫描振镜、扫描镜头和筒镜调节后进入物镜激发样品。


4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：激发产生的荧光信号经物镜汇聚后，经过反射镜、筒镜、扫描镜头、扫描振镜后，经过滤除激发光的二色镜后再分成多路信号；
根据权利要求4所述的系统，其特征在于：滤除激发光的二色镜和根据荧光波长分成多路信号的二色镜之间设有一聚光透镜。


5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：样品的荧光信号由至少三个二色镜按照光谱波长分成至少四个检测光路。


6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：检测光路的荧光信号均由...

【专利技术属性】
技术研发人员：董朝青，任吉存，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31