一种检测酪氨酸酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种不需要标记、不需要复杂合成、利用常见化合物的组合来检测酪氨酸酶活性的荧光方法。将葫芦[8]脲(CB[8])、硫黄素T(ThT)和多肽YLA或Dopa‑LA三者按比例简单混合，即可用于检测酪氨酸酶的活性。具体而言，在CB[8]‑ThT‑YLA/Dopa‑LA溶液中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，在激发波长为417 nm、发射波长为570 nm下进行荧光测量，得到荧光信号随时间变化的曲线，进一步推算出酶反应速率与酶浓度关系，经简单线性拟合即可定量检测酪氨酸酶浓度。本发明专利技术的方法不需要合成复杂的荧光分子或材料，且可以对酪氨酸酶的活性进行连续监测，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种检测酪氨酸酶活性的方法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种酪氨酸酶活性的荧光检测方法。
技术介绍
酪氨酸酶是一种含铜金属氧化还原酶，在微生物、动物、植物和人体中都有分布，其在黑色素的代谢过程中起到很重要的作用。酪氨酸酶可以催化酪氨酸转变为多巴，然后氧化多巴形成多巴醌，多巴醌在生物体内经过一系列反应后，可以形成黑色素。酪氨酸酶活性过高或缺失，都会影响黑色素的产生，进而可能引起雀斑、褐斑、皮肤癌、白癜风、白化病、黑色素瘤等疾病。因此，开发酪氨酸酶活性检测方法具有重要意义。由于酪氨酸酶的底物是酪氨酸、多巴等含酚羟基的分子，目前使用的荧光探针多数是酚类衍生物或者含酚类衍生物的材料，大部分需要进行相对复杂的化学合成。本专利技术中使用的大环分子葫芦[8]脲(CB[8])、荧光分子硫黄素-T(ThT)和多肽YLA或Dopa-LA均是可以购买得到的，不需要经过复杂的合成。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用荧光来检测酪氨酸酶活性的方法。该方法不需要标记、不需要合成复杂的荧光分子或材料，且可以对酪氨酸酶的活性进行连续监测，应用前景广阔。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA体系将多肽YLA或Dopa-LA与ThT、CB[8]以不同摩尔比在缓冲液中均匀混合，孵育适当时间后，在激发波长417nm、发射波长450nm-699nm下进行光谱扫描，同时测定激发波长为417nm、发射波长为570nm的荧光信号值。2.酪氨酸酶活性的检测将CB[8]、ThT和YLA/Dopa-LA以特定摩尔比在缓冲液中均匀混合后恒温孵育一定时间，把不同浓度酪氨酸酶溶液加入上述体系，在激发波长417nm、发射波长570nm下进行持续荧光测量，每隔1min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率，经线性拟合发现速率与酶浓度成正比，表明该方法可用于测定酪氨酸酶活性。3.曲酸抑制酪氨酸酶活性的检测将酪氨酸酶与不同浓度的抑制剂分子恒温孵育一定时间后，加入特定摩尔比的CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液；在激发波长为417nm、发射波长为570nm下进行荧光信号强度测定，同样每隔1min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率与抑制剂浓度的关系，进一步的可以计算出抑制剂的IC50值。本专利技术的检测原理：ThT分子可以与CB[8]结合，且结合后荧光信号会增强；多肽YLA或Dopa-LA也可以结合CB[8]，那么在CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA的三元体系中，若多肽浓度较高，则ThT与CB[8]结合较少，其荧光信号增强的幅度会降低；在酪氨酸酶的作用下多肽YLA/Dopa-LA会被氧化成复杂产物，这些产物与CB[8]结合力很弱，因此ThT与CB[8]的结合会变多，荧光信号会增强。据此，我们根据CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA这个三元体系在加入酪氨酸酶后荧光信号增强的快慢，即可测定酪氨酸酶的活性。本专利技术的有益效果在于：本专利技术建立的基于CB[8]-荧光分子-多肽的三元体系，能快速、准确地实现对酪氨酸酶活性进行连续监测；整个操作过程非常简单，无需任何修饰和标记，成本低廉，具有较强的应用性。附图说明图1A.酪氨酸酶氧化酪氨酸形成多巴及后续产物。B.本方法实施例中用到的分子结构式。C.本专利技术方法的原理示意图。图2为CB[8]结合ThT以及YLA/Dopa-LA竞争CB[8]和ThT及之间结合力的荧光发射光谱图。A.随CB[8]浓度增加，左：ThT荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。B.CB[8]-ThT体系中，随着YLA浓度增加，左：荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。C.CB[8]-ThT体系中，随着Dopa-LA浓度增加，左：荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。图3中左图为CB[8]、ThT和YLA(A)/Dopa-LA(B)体系与不同浓度的酪氨酸酶反应的荧光强度随时间的变化图；右图为酶促反应速率与酶浓度的线性拟合。图4是曲酸浓度与酪氨酸酶活性的关系，A.CB[8]-ThT-YLA体系；B.CB[8]-ThT-Dopa-LA体系；C.L-Dopa体系。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术中的酪氨酸酶活性的荧光检测方法做进一步说明。实施例1（1）CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA体系：在磷酸盐缓冲液中，用1.5mLep管将3μMThT、10μMCB[8]和不同浓度的YLA/Dopa-LA均匀混合在金属浴37℃下孵育10min后，添加到96孔黑板中。在激发波长为417nm、发射波长为450nm-699nm，37℃恒温下的酶标仪中进行光谱扫描。同时测定激发波长为417nm、发射波长为570nm的荧光信号值。（2）酪氨酸酶活性检测：将3μMThT、10μMCB[8]和20μMYLA/Dopa-LA在磷酸缓冲液中均匀混合在96孔黑板中，37℃恒温下孵育10min。不同浓度的酪氨酸酶（浓度为0,10,25,50,75,100,125nM）同样添加到96孔黑板中在37℃恒温下孵育10分钟。用排枪将孵育好的酶加入CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA混合液,在激发波长和发射波长分别为417nm和570nm，37℃恒温下，在酶标仪中对酪氨酸酶的活性进行连续监测。（3）曲酸抑制酶活性检测：把100nM酪氨酸酶和不同浓度曲酸（浓度为0,0.1,1,5,10,20,40,80,100,200,400,800,1200,2000μM）添加到96孔黑板中，在37℃下恒温孵育20min。用1.5mLep管将3μMThT、10μMCB[8]和20μMYLA/Dopa-LA在磷酸缓冲液中混合，同样在37℃恒温下孵育20min。用排抢将CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA混合液加入到曲酸和酶的混合液中，在激发波长和发射波长分别为417nm和570nm，37℃恒温的酶标仪中连续监测酪氨酸酶的活性。从图2中可以看出CB[8]与ThT结合后会增强ThT的荧光强度，同时最大发射波长从480nm附近偏移到570nm（图2A）；YLA（图2B）或Dopa-LA（图2C）竞争结合CB[8]后会使ThT荧光信号强度降低，同时最大发射波长从570nm回复到480nm附近。图3（左）为CB[8]、ThT、YLA/Dopa-LA与不同浓度的酪氨酸酶反应的荧光强度随时间的变化图(A:YLA,B:Dopa-LA)。从图中可以看出荧光信号强度增加的速率随着酶浓度升高而升高。根据图3（左）可以拟合出酶促反应速率，进一步对不同酶浓度下的酶促反应速率作图，发现速率与酶浓度之间有着良好的线性关系，见图3（右）。图4为利用曲酸抑制酶活性的曲线。从图中可以看出随着曲酸浓度的增加，酪氨酸酶的活性不断降低，在YLA(A)、Dop本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测酪氨酸酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液的制备：将多肽YLA或Dopa-LA与硫黄素T、葫芦[8]脲在缓冲液中均匀混合后恒温孵育；/n（2）酪氨酸酶活性的检测：在CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，持续进行荧光信号强度测定，每隔1 min测一次；根据荧光信号随时间变化的曲线，计算出酶催化反应的速率，利用反应速率与酶浓度成正比，推算出酪氨酸酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测酪氨酸酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液的制备：将多肽YLA或Dopa-LA与硫黄素T、葫芦[8]脲在缓冲液中均匀混合后恒温孵育；
（2）酪氨酸酶活性的检测：在CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，持续进行荧光信号强度测定，每隔1min测一次；根据荧光信号随时间变化的曲线，计算出酶催化反应的速率，利用反应速率与酶浓度成正比，推算出酪氨酸酶活性。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：恒温孵育的温度为室温～45℃。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的CB[8]-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李高，蔡永其，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：福建;35