长序榆高效再生体系的建立方法技术

本发明专利技术长序榆高效再生体系的建立方法，按下列步骤进行：1）愈伤组织诱导培养；2）不定芽诱导培养；3）不定芽增殖培养；4）壮苗培养；5）分化苗生根培养；6）再生植株的移栽。本发明专利技术通过使用较少的植物激素就可以高效地达到预期繁育长序榆的目的，降低因激素价格高带来的高成本；牛血清蛋白的加入，一方面可以提供植物新生芽萌发与增殖对营养物质的需求，另一方面还可有效预防组织褐化带来的组织死亡；两步驯化法，简单易行，操作简便，可以有效提高小苗成活率。

【技术实现步骤摘要】
长序榆高效再生体系的建立方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体是以长序榆的腋芽为外植体，经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖、壮苗、生根、移栽，实现高效再生，为其遗传转化研究奠定基础。
技术介绍
长序榆隶属于榆科榆属，是落叶乔木。其树干通直，材质细腻优良，截面具天然美丽轮纹，是高档家居板材来源树种之一。长序榆原产北美，因环境等变化原因，长序榆最后灭绝，而长序榆在我国的发现（是我国特有树种），不仅丰富了我国榆属植物资源，而且其对于研究北美和东亚植物区系具有重要的科学意义。在我国，长序榆群落零星分散，自然更新困难，被列为国家2级重点保护树种。加上人类活动的影响，长序榆原生境被干扰破坏，种群面临濒危灭绝的境地。目前，为了拯救这一濒危树种，科技人员主要从长序榆生境的保护及资源调查分布展开了研究。对于繁育而言，榆科植物的繁育手段只见于常见园林观赏树种的嫁接（如金叶榆、欧洲白榆、垂榆等）以及个别榆科树种（如裂叶榆等）的播种繁育，组培技术在长序榆甚至在榆科植物中的研究及应用还鲜有报道。由于树种的遗传个体差异，造成植物本身对生长环境的适应及种群延续策略而有所不同。嫁接技术是无性繁殖植物的一种有效方法，但是嫁接繁殖受季节限制，并不能全年生产，并不能满足市场对大量苗木的需求。种子繁殖虽然可以短时间可以获取大量苗木，但种子繁育并不能完全保留母本的优良性状。因此，如何快速高效周年生产大量苗木，且保留母本的优良性状，是科技工作者不断研究的课题。因此，细胞工程技术（组织培养技术）在快繁植物方面获得了广泛应用。但是，由于物种的本身特性的差异，并不是每一种植物都可以通过组培获取再生的幼苗。因此，每种植物的组培技术方法需要不断的优化探索，突破组培中关键的如组织褐化、玻璃化及生根率低等瓶颈技术。对于长序榆而言，一是由于其种群数量及其稀少，且一般生长在深山高海拔、地势险要的生境，二是长序榆树干通直，高大，采集大量的嫁接枝条及其困难，三是长序榆果实小而轻，且密被白色长柔毛，极易被风吹散，采种困难。因此，如何利用现有的有限资源，快速高效繁育长序榆，且保留母本的优良性状，文献鲜有报道。因此，本研究对长序榆展开了为期多年的组培繁育研究，获得了较为成熟的技术方法，为扩大长序榆种群数量，也为进一步展开长序榆研究提供更多的苗木，提供了技术支持。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术利用长序榆的芽为外植体，经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖、壮苗、生根、移栽，建立其再生体系的方法。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：1）愈伤组织诱导培养从当年生休眠枝条中剪取带有一个腋芽的茎段，自来水冲洗30min后，75%酒精浸泡2min，再用质量比浓度为0.1%的升汞消毒8min，在超净工作台中用无菌水冲洗5次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.3-0.5cm，每管一个芽接种于诱导培养基中，诱导基本培养基为MS，添加的外源激素为6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、TDZ即噻重氮苯基脲、GA3即赤霉素，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为35µmol/©O.s，诱导培养25±2d，愈伤组织形成；2）不定芽诱导培养把诱导的愈伤组织切成小块转接到诱导芽培养基中，进行不定芽诱导，不定芽诱导基本培养基为MS，添加6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55mol/©O.s，培养51±2d，簇状不定芽形成；3）不定芽增殖培养把诱导的簇状不定芽切成带有5-8个不定芽的小块，转接到芽增殖培养基中，芽增殖培养基本培养基为改良MS，添加TDA、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55µmol/©O.s，培养30±2d，增殖出大量不定芽茎段；4）壮苗培养把增殖出来的不定芽茎段切成长约2cm的茎段，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基本培养基为MS，添加6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55µmol/©O.s，培养21±2d；5）分化苗生根培养剪取经过壮苗培养的茎段，长2.5-3.5cm，接种到生根培养基中进行生根诱导，生根基本培养基为1/2MS，添加NAA即萘乙酸、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55µmol/©O.s，培养15±2d；6）再生植株的移栽对生根的茎段移栽到栽培基质前，拧松培养瓶盖，在瓶内倒入少许无菌水，于室内炼苗3d，而后清洗掉根部粘连的培养基，移栽于混合培养基质中，进行常规栽培管理。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）-4）中的培养基中蔗糖的添加量为30g/L，步骤5）中蔗糖的添加量为2g/L，步骤1）-5）的培养基中琼脂添加量均为4.8g/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中6-BA的浓度为2mg/L、TDZ的浓度为0.1mg/L、GA3的浓度为0.1mg/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤2）中6-BA的浓度为2mg/L、IBA的浓度为0.2mg/L、牛血清蛋白20mg/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤3）中TDA的浓度为1.5mg/L、IBA的浓度为0.1mg/L、牛血清蛋白的浓度为15mg/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤3）中改良MS为MS培养基组成中有机成分比正常增加一倍，其它组分保持不变。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤4）中6-BA浓度为1mg/L、IBA浓度为0.3mg/L、牛血清蛋白浓度为15mg/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤5）中NAA浓度为0.2mg/L、IBA浓度为0.1mg/L、牛血清蛋白浓度为15mg/L。所述的长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤6）中混合培养基质由蛭石和珍珠岩混合而成，两者的体积比为蛭石：珍珠岩=4:1。本专利技术通过使用较少的植物激素就可以高效地达到预期繁育长序榆的目的，降低因激素价格高带来的高成本；牛血清蛋白的加入，一方面可以提供植物新生芽萌发与增殖对营养物质的需求，另一方面还可有效预防组织褐化带来的组织死亡；两步驯化法，简单易行，操作简便，可以有效提高小苗成活率。附图说明图1为诱导出的长序榆愈伤组织的形态图；图2为经过壮苗阶段的长序榆茎段图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，并给出具体实施方式。实施例长序榆高效再生体系的建立方法，按下列步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：/n1）愈伤组织诱导培养/n从当年生休眠枝条中剪取带有一个腋芽的茎段，自来水冲洗30min后，75%酒精浸泡2min，再用质量比浓度为0.1%的升汞消毒8min，在超净工作台中用无菌水冲洗5次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.3-0.5cm，每管一个芽接种于诱导培养基中，诱导基本培养基为MS，添加的外源激素为6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、TDZ即噻重氮苯基脲、GA

【技术特征摘要】
1.长序榆高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：
1）愈伤组织诱导培养
从当年生休眠枝条中剪取带有一个腋芽的茎段，自来水冲洗30min后，75%酒精浸泡2min，再用质量比浓度为0.1%的升汞消毒8min，在超净工作台中用无菌水冲洗5次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.3-0.5cm，每管一个芽接种于诱导培养基中，诱导基本培养基为MS，添加的外源激素为6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、TDZ即噻重氮苯基脲、GA3即赤霉素，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为35µmol/©O.s，诱导培养25±2d，愈伤组织形成；
2）不定芽诱导培养
把诱导的愈伤组织切成小块转接到诱导芽培养基中，进行不定芽诱导，不定芽诱导基本培养基为MS，添加6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55mol/©O.s，培养51±2d，簇状不定芽形成；
3）不定芽增殖培养
把诱导的簇状不定芽切成带有5-8个不定芽的小块，转接到芽增殖培养基中，芽增殖培养基本培养基为改良MS，添加TDA、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，pH为5.9-6.0，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55µmol/©O.s，培养30±2d，增殖出大量不定芽茎段；
4）壮苗培养
把增殖出来的不定芽茎段切成长约2cm的茎段，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基本培养基为MS，添加6-BA即6-苄氨基腺嘌呤、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，培养条件为：培养室温度设定为23-25℃，光照时间13h，光照强度为50-55µmol/©O.s，培养21±2d；
5）分化苗生根培养
剪取经过壮苗培养的茎段，长2.5-3.5cm，接种到生根培养基中进行生根诱导，生根基本培养基为1/2MS，添加NAA即萘乙酸、IBA即吲哚丁酸、牛血清蛋白，培...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪震，洪琮浩，
申请(专利权)人：华东药用植物园科研管理中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33