使用RNA分析以检测疾病的方法技术

本发明专利技术提供多种用于检测核糖核酸(RNA)分子的亚群的方法。在一些实施例中，本发明专利技术提供多种从获自一受试者的一测试样品中的多个RNA分子所产生的定序库的方法，以及多种用于分析所述定序库以检测例如疾病的存在或不存在的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用RNA分析以检测疾病的方法
本申请请求于2018年12月18日所提交的美国临时申请案第62/781,512号以及2019年5月3日所提交的美国临时申请案第62/843,109号的权益，出于所有的目的，此等申请通过引用整体并入本文中。
技术介绍
截至2017年，美国每年总共有超过160万个新病例，癌症是一突出的全球公共健康问题。参见西格尔等人，2017年，“癌症统计数据”，CACancerJClin.67(1)：7-30。筛检计划及早期诊断对于提高癌症患者的无病生存率及降低死亡率具有重要的影响。由于早期诊断的非侵入性方法可培养患者的依从性，因此可将其纳入筛检计划。游离核酸(cfNA)可在血清、血浆、尿液及其他体液中找到(陈等人，“临床生物化学家协会的临床科学审查委员会，在血浆、血清及尿液中的游离核酸：分子诊断的新工具”，AnnClinBiochem.2003；40(Pt2):122-130)代表“液体活检”，其是一特定疾病的循环照片。参见德马托斯-阿鲁达及卡尔达斯，2016，“游离循环肿瘤DNA作为乳腺癌的液体活检”，MolOncol.2016；10(3):464–474。同样地，游离RNA已被提议作为癌症检测的可能分析物。参见齐马焦尔吉斯等人，“从体液中恢复循环的细胞外或游离RNA，”癌症流行病学，2011；35(6)：580-589。此等方法代表筛检各种疾病，例如癌症的潜在非侵入性方法。然而，癌症仍然是全世界常见的死亡原因。在过去的数十年中，治疗选择已经有所改善，然而存活率仍然很低。通过手术切除及基于药物的方法治疗的成功在极大的程度上是取决于早期肿瘤的识别。然而，目前的技术，诸如成像及基于生物标志的方法，通常在疾病进入更晚期阶段之前无法识别肿瘤。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)是一种肝脏疾病，其特征在于肝细胞的炎症及损伤。通常，NASH及相关疾病，例如非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)，包括与脂肪堆积相关的肝脏炎症，及类似于酒精性肝炎，但其是在很少或从不饮酒的患者中所观察到。NASH及NAFLD在男性及女性中经常被报道，尽管其最常出现在女性中，且在肥胖人群中尤其普遍。尽管已观察到所述疾病伴随有其他数种病理状况，包括糖尿病、高脂血症、高血糖症、“代谢综合征”的所有部分、疾病的原因及进展，以及与此等病症的因果关系或时间关系条件，并无全然的了解。然而，特别是在罹患NAFLD及NASH的患者中，肝组织的某些特征及功能异常是典型的。具体而言，脂肪沉积、组织变性、炎症、细胞变性、肝硬化、游离脂肪酸升高以及其他此此种异常已与非酒精性脂肪性肝炎相关，且常见于罹患各种形式的NAFLD的患者中。目前，肝活检在临床实施中被用作检测与NAFLD、NASH、肝纤维化及肝硬化相关的肝病的主要方法。然而，由于活检往往是侵入性的、痛苦的、昂贵的、受采样错误影响且可能不适用于所有患者，使用侵入性肝活检作为评估肝病病症的主要手段阻碍了诊断，及后续的治疗。据此，当治疗干预具有更大的成功机会时，仍然需要能够在最早阶段识别疾病的新的非侵入性检测方式。本专利技术满足此等及其他的需求。
技术实现思路
在各个方面，本公开提供多种用于检测一受试者的疾病状态的方法及组合物。在实施例中，所述方法包括检测在游离核糖核酸(cell-freeribonucleicacid,cfRNA)中的一或多个标志。在实施例中，检测cfRNA包括步骤：定序从一受试者的一生物样品的cfRNA，以产生cfRNA读值。在实施例中，所述方法进一步包括定序从一受试者的细胞的RNA，以产生细胞读值，以及过滤所述cfRNA读值，以排除对应于一或多个细胞读值的cfRNA读值。在实施例中，细胞是血细胞。在实施例中，所述方法包括步骤：过滤cfRNA读值，以排除一或多个核糖体、线粒体及/或血液相关的转录物。在实施例中，仅检测与一外显子-外显子连接重叠的cfRNA读值(或读值对)。在实施例中，检测对应于一或多个标志的cfRNA(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多标志)。所述一或多个标志可为本文中所公开的任何标志的任意组合。在实施例中，所述一或多个标志与疾病状态相关。在实施例中，多个方法包括治疗一受试者的疾病状态。本专利技术的方面包括多种用于检测一受试者的一疾病状态的方法，所述方法包括步骤：从所述受试者分离一生物测试样品，其中所述生物测试样品包括多个游离核糖核酸(cfRNA)分子；从所述生物测试样品中提取多个cfRNA分子；定序所述经提取的cfRNA分子，以产生多个序列读值；进行一过滤程序，以产生源自一或多个健康细胞的一排除的序列读值的群，以及一非排除的序列读值的群；对所述非排除的序列读值进行一量化程序；以及当所述量化过程产生超过一阈值的数值时，检测所述受试者的疾病状态。在实施例中，检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括：(i)检测，(ii)在高于背景进行检测，或(iii)在一水平进行检测，所述水平大于在未罹患所述病症的受试者中相应的序列读值的一水平。本专利技术的方面进一步包括多种用于鉴定表明一疾病状态的一或多个RNA序列的计算机实施的方法，所述方法包括：通过一计算机系统，从来自已知罹患所述疾病的一受试者的一第一测试样品的多个RNA分子的一第一组序列读值，其中所述第一测试样品包括多个游离RNA(cfRNA)分子；通过一计算机系统，从一对照样品的多个RNA分子中获得一第二组序列读值；通过一计算机系统，检测存在于所述第一组序列读值中且不存在于所述第二组序列读值中的一或多个RNA序列，以鉴定表明所述疾病状态的一或多个RNA序列。在其他方面，本专利技术涉及多种用于检测一受试者中一或多个肿瘤衍生的RNA分子的计算机实施方法，所述方法包括步骤：通过一计算机系统，从来自已知罹患或疑似罹患一肿瘤的一受试者的一第一测试样品的多个RNA分子的一第一组序列读值，其中所述第一测试样品包括多个游离RNA(cfRNA)分子；通过一计算机系统，从所述受试者的多个血细胞的多个RNA分子中获得一第二组序列读值；以及通过一计算机系统，检测存在于所述第一组序列读值中且不存在于所述第二组序列读值中的一或多个RNA序列，以检测在所述受试者中的一或多个肿瘤衍生的RNA分子。在其他方面，本专利技术涉及多种用于在已知罹患或疑似罹患一癌症的一受试者中检测癌症的存在、确定癌症阶段、监控癌症进展及/或确定一癌症类型或癌症亚型的方法，所述方法包括步骤：(a)从所述受试者获得一生物测试样品，其中所述生物测试样品包括多个游离核糖核酸(cfRNA)分子；(b)定量检测在所述生物测试样品中衍生自一或多个靶RNA分子的一或多个核酸序列的存在，以确定一肿瘤RNA分数，其中所述一或多个靶RNA分子选自列出的靶RNA分子是选自表1至表3中的任一者；(c)当所述肿瘤RNA分数超过一阈值时，在所述受试者中检测所述癌症的存在、确定所述癌症阶段、监控所述癌症进展及/或确定所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测一受试者的游离RNA(cfRNA)分子的一亚群的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：/n(a)定序所述cfRNA分子，以产生cfRNA序列读值；/n(b)定序从所述受试者的细胞中所提取的细胞的RNA，以产生细胞的序列读值；/n(c)进行一过滤程序，以产生一非排除的cfRNA序列读值的群，其中所述过滤包括排除与一或多个所述细胞的序列读值相匹配的cfRNA序列读值；以及/n(d)量化一或多个所述非排除的序列读值。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181218 US 62/781,512;20190503 US 62/843,1091.一种检测一受试者的游离RNA(cfRNA)分子的一亚群的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
(a)定序所述cfRNA分子，以产生cfRNA序列读值；
(b)定序从所述受试者的细胞中所提取的细胞的RNA，以产生细胞的序列读值；
(c)进行一过滤程序，以产生一非排除的cfRNA序列读值的群，其中所述过滤包括排除与一或多个所述细胞的序列读值相匹配的cfRNA序列读值；以及
(d)量化一或多个所述非排除的序列读值。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：定序所述cfRNA分子包括：进行反转录以产生cDNA分子，以及定序所述cDNA分子，以产生所述cfRNA序列读值。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：定序所述cfRNA分子包括步骤：
(a)反转录所述cfRNA分子，以产生多个cDNA/RNA杂合分子；
(b)从所述cDNA/RNA杂合分子合成多个双股cDNA分子；
(c)将多个双股多核苷酸接头连接至所述多个双股cDNA分子上，从而产生一定序库；以及
(d)定序所述定序库的至少一部分，以产生所述cfRNA序列读值。


4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：定序所述cfRNA分子包括：全部的转录组的定序。


5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：定序所述cfRNA分子包括：针对一或多个靶多核苷酸富集所述cfRNA分子或其cDNA分子。


6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述非排除的序列读值仅包括与一外显子-外显子连接重叠的读值或读值对。


7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述cfRNA来自所述受试者的一生物测试样品，所述生物测试样品包括一生物流体。


8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述生物流体包括：血液、血浆、血清、尿液、唾液、胸膜液、心包液、脑脊液(CSF)、腹膜液或其任意组合。


9.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述cfRNA分子是从所述受试者的血液、一血液级分、血浆或血清中获得。


10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞是从所述受试者的血液或一血液级分中获得。


11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述cfRNA分子及所述细胞是从所述受试者的一血液样品中获得。


12.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞是白细胞(WBC)。


13.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：检测所述受试者的一病症，其中检测所述病症包括：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值。


14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括：(i)检测，(ii)在高于背景进行检测，或(iii)在一水平进行检测，所述水平大于在未罹患所述病症的受试者中相应的序列读值的一水平。


15.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括：在一水平检测所述一或多个序列读值，所述水平大于在未罹患所述病症的受试者中相应的序列读值的一水平的至少10倍。


16.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括：检测高于0.5至5个读值/百万(RPM)的一阈值。


17.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括步骤：
(a)确定多个靶cfRNA分子的一表达水平；
(b)通过比较各所述靶cfRNA分子的所述表达水平与一RNA组织分数矩阵，以确定各靶cfRNA分子的一指标分数；
(c)汇总各靶cfRNA分子的所述指标分数；以及
(d)当所述指标分数超过一阈值时，检测存在于所述受试者中的所述病症。


18.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的一或多个非排除的序列读值包括：将所述序列读值读入一机器学习或深度学习模型。


19.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述机器学习或深度学习模型包括逻辑回归、随机森林、梯度提升机、朴素贝叶斯、神经网络或多项式回归。


20.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述机器学习或深度学习模型通过包括学习权重的一函数，将所述一或多个特征的所述值转换为所述受试者的所述疾病状态预测。


21.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述病症是心血管疾病、肝脏疾病或癌症。


22.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述病症是一肝脏疾病，所述肝脏疾病是选自非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌(HCC)及其任意组合。


23.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述病症是一癌症，所述癌症包括：
(i)癌症、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、生殖细胞肿瘤或其任意组合；
(ii)选自由下述所组成的群组的癌症：腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、膀胱癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、甲状腺癌、黑色素瘤及乳腺癌；
(iii)激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌；
(iv)选自由下述所组成的群组的肉瘤：骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、间皮肉瘤(间皮瘤)、纤维肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神经胶质瘤及星形细胞瘤；
(v)选自由下述所组成的群组的白血病：骨髓性、粒细胞性、淋巴性、淋巴细胞性及淋巴胚细胞性白血病；或
(vi)选自由下述所组成的群组的淋巴瘤：霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤。


24.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值源自一患病细胞的一转录物，且所述方法进一步包括：鉴定所述患病细胞的组织来源的步骤。


25.如权利要求24所述的方法，其特征在于：所述组织来源是选自由胰腺组织、肝组织、肺组织、脑组织、子宫组织、肾组织、乳腺组织、脂肪、结肠组织、直肠组织、心脏组织、骨骼肌组织、前列腺组织及甲状腺组织所组成的群组。


26.如权利要求13至23中任一项所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值源自一癌细胞的一转录物，且所述方法进一步包括确定在所述受试者中的所述癌症的起源的癌细胞类型或组织。


27.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是从所述cfRNA分子或其扩增子所富集的一或多个靶多核苷酸的序列读值。


28.如权利要求13所述的方法，其特征在于：检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自1至20个靶基因的cfRNA分子的序列读值。


29.如权利要求13所述的方法，其特征在于：(i)所述病症是癌症，以及(ii)检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自一或多个基因的cfRNA分子的读值，所述一或多个基因是选自由AGR2、BPIFA1、CASP14、CSN1S1、DISP2、EIF2D、FABP7、GABRG1、GNAT3、GRHL2、HOXC10、IDI2-AS1、KRT16P2、LALBA、LINC00163、NKX2-1、OPN1SW、PADI3、PTPRZ1、ROS1、S100A7、SCGB2A2、SERPINB5、SFTA3、SFTPA2、SLC34A2、TFF1、VTCN1、WFDC2、MUC5B、SMIM22、CXCL17、RNU1-1及KLK5所组成的群组。


30.如权利要求13所述的方法，其特征在于：(i)所述病症是癌症，以及(ii)检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自一或多个基因的cfRNA分子的读值，所述一或多个基因是选自由ROS1、NKX2-1、GGTLC1、SLC34A2、SFTPA2、BPIFA1、SFTA3、GABRG1、AGR2、GNAT3、MUC5B、SMIM22、CXCL17及WFDC2所组成的群组。


31.如权利要求13所述的方法，其特征在于：(i)所述病症是乳腺癌，以及(ii)检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自一或多个基因的cfRNA分子的读值，所述一或多个基因是选自由SCGB2A2、CSN1S1、VTCN1、FABP7、LALBA、RNU1-1、OPN1SW、CASP14、KLK5及WFDC2所组成的群组。


32.如权利要求13所述的方法，其特征在于：(i)所述病症是乳腺癌，以及(ii)检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自一或多个基因的cfRNA分子的读值，所述一或多个基因是选自由CASP14、CRABP2、FABP7、SCGB2A2、SERPINB5、TRGV10、VGLL1、TFF1及AC007563.5所组成的群组。


33.如权利要求13所述的方法，其特征在于：(i)所述病症是肝癌，以及(ii)检测高于一阈值的所述一或多个非排除的序列读值是衍生自一或多个基因的cfRNA分子的读值，所述一或多个基因是选自由AKR1B10、C3及PIEXO2所组成的群组。


34.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：基于所检测到的所述病症选择一治疗方式。


35.如权利要求34所述的方法，其特征在于：所述病症是癌症，以及所述治疗方式包括手术切除、放射疗法或施用一抗癌剂。


36.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：使用所述所选择的治疗方式治疗所述受试者。


37.一种检测一受试者的癌症的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
(a)检测在所述受试者的一样品中的多个靶游离RNA(cfRNA)分子，其中所述多个靶cfRNA分子是选自表1至表7中的一或多个转录物；以及
(b)检测所述癌症，其中检测所述癌症包括检测高于一阈值水平的一或多个所述靶cfRNA分子。


38.如权利要求37所述的方法，其特征在于：所述多个靶cfRNA分子是选自表1至表7中的至少5、10、15或20个转录物。


39.如权利要求37所述的方法，其特征在于：所述多个靶cfRNA分子包...

【专利技术属性】
技术研发人员：雯莹·潘，马修·拉森，约翰·H·金，阿拉什·詹姆席狄，
申请(专利权)人：格里尔公司，
类型：发明
国别省市：美国;US