一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，包括以下步骤：A、ARTP诱变菌株保藏，B、验证并确定低耗糖菌株，C、选育验证，D、遗传性检测；利用此方案得到的新菌株对碳源的利用量更低，可以直接降低生产成本，带来直接的经济效益；且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低，可以一定程度上缓解三废处理的压力，本方法获得的菌种具有遗传稳定性，可供给大规模生产使用。

【技术实现步骤摘要】
一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法。
技术介绍
硫酸粘杆菌素(ColistinSulfate)又名粘杆菌素、抗敌素、多粘菌素E，是从多粘芽胞杆菌变种(Bacilluspolymyxavar.colistimus)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。近十几年来，由于药物残留和耐药问题对人类产生的潜在危害日益突出，发达国家相继禁用了若干种饲用抗生素。硫酸粘杆菌素因内服胃肠道不易吸收，不易产生耐药性，对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌等有强大的抗菌作用而引起畜牧兽医工作者的关注。美国和欧盟将其批准作为兽药使用，在日本还被用作饲料添加剂。我国在20世纪90年代末由山东鲁抗医药集团成功研制了硫酸粘杆菌素及其制剂，并于2002年被农业部批准为国家三类新兽药。尽管基因工程技术已经开始用于工业生产高产菌株的构建，但是物理、化学诱变因子如紫外线、高频电子流、亚硝基胍等仍然是遗传育种不可或缺的手段。为了提高诱变后高产菌株的筛选效率，人们设计了各种筛选方案，如川氏设计了琼脂块法，ElanderRP.等人提出利用前体及结构类似物抗性的筛选方法，它们在菌种选育中取得了较好的效果。周希贵、戴鹏高等公开了一种“粘杆菌素高产菌株的选育”方法(中国知网)，用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1541进行诱变，采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为32.3％。目前进行的相关研究多是围绕提高效价为目的，但是随着环境管理的升级，危废的安全治理，生产成本的增加，成为企业生存的命脉，成本的节降成为目前大多数企业解决的头等大事。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述现有技术中存在的问题，针对影响粘菌素生产成本最大的关键因素-碳源的用量，进行了根本性的解决，提供了一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，提不仅提高了效价，降低了碳源的使用量，而且残糖的降低，直接减少了对尾废治理的压力。本专利技术采用的具体技术方案是：一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，关键是，包括以下步骤：A、ARTP诱变菌株保藏1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行ARTP诱变，得到诱变菌株，所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀；3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养，平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；4)、在3)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；5)、将4)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL即可；6)、将5)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液；B、验证并确定低耗糖菌株7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中，进行培养，所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中，进行培养，所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中，进行考察，所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：同7)；10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中，进行培养，所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉72.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4；培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；所用发酵瓶D2培养基成分及配比及培养条件：同8)所用发酵瓶D3培养基成分及配比为(g/L)：淀粉27.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；11)、将10)中生长到周期的D3进行稀释分离并接种Z培养基进行验证，平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3..0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；所用发酵瓶Z培养基及培养条件：同7)；12)、在11)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；13)、将12)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；14)、将13)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏；15)、将11)中培养到周期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖；16)、根据15)中检测结果确定低耗糖菌株；C、选育验证17)、将16)中确定的低耗糖菌株进行自然分离到平板培养基上进行培养，平板培养基及培养条件同11)；18)、在17)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，生长16h后得到活化液；19)、将18)中的活化液接种Z发酵瓶，所用发酵瓶Z培养基及培养条件同7)；20)、对19)中使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖。优选的，还包括步骤D、遗传性检测21)、将1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、ARTP诱变菌株保藏/n1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养/n所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；/n培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；/n2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到10

【技术特征摘要】
1.一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、ARTP诱变菌株保藏
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行ARTP诱变，得到诱变菌株，
所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀；
3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；
4)、在3)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；
5)、将4)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；
40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL即可；
6)、将5)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液；
B、验证并确定低耗糖菌株
7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；
8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中，进行考察，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：同7)；
10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉72.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑万静，徐珍，刘聪洁，韩冰，
申请(专利权)人：河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北;13