低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法技术

本发明专利技术公开了一种低产乙醛啤酒酵母的高效选育方法，属于菌株选育的技术领域。本发明专利技术通过对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；利用乙醇‑双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变‑筛选‑驯化的初筛菌株；对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，获得乙醛产量降低50％以上的低产乙醛啤酒酵母。本发明专利技术解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。

【技术实现步骤摘要】
低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法
本专利技术属于啤酒酿造
，尤其涉及一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法。
技术介绍
与其他酒精饮料相比，啤酒因其储藏过程中老化风味物质的积累，而具有较短的货架期。这些老化风味化合物主要由低风味阈值的醛类化合物所组成。啤酒灌装时，醛类化合物主要以结合态形式存在，含量在风味阈值之下；随储酒时间的延长，醛类化合物大量释放，啤酒中老化风味突出，风味稳定性下降。乙醛(CH3CHO)是啤酒中主要的老化醛类化合物，具有较高的挥发性和反应活性，直接影响了啤酒的风味和风味稳定性。随着饮料工业的发展，啤酒生产企业维持酒体风味稳定、延长产品货架期的愿望更加迫切。因此，研究学者相继提出了很多控制乙醛含量的工艺措施，然而多数的工艺优化没有普遍适用性，同样的措施应用于不同的菌种和工艺条件下可能会出现不同甚至相反的结果。而啤酒酵母从根本上决定了啤酒产品中风味物质乙醛的形成和积累。一方面，酵母自身代谢产生了乙醛等老化物质；另一方面啤酒酵母具有很好的还原活性，其本身可以还原发酵液中的乙醛。因此，选育性能优良的低产乙醛啤酒酵母菌株将成为有效提升啤酒风味稳定性、解决啤酒食品安全问题的途径之一。迄今为止，研究者为了获得低产乙醛的实验和生产菌株采取了很多技术手段，主要包括传统育种手段、同源重组手段和酵母“基因自克隆技术”。鉴于啤酒酵母应用领域的特殊性，啤酒研究者和酿造者更加倾向于采用传统育种技术选育低产乙醛啤酒酵母菌株。然而采用传统育种技术获得所需表型的概率低，性状回复突变率高。因此，研究高效、稳定和安全的育种技术在构建低产乙醛的啤酒工业酵母中具有重要的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，该方法解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。作为优选，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：将培养至对数中期的菌体稀释至1×106个/mL，利用氦气离子束对酵母细胞进行ARTP诱变处理。作为优选，所述ARTP诱变处理的条件为：氦气流速15.0L/min、输入功率100W、处理距离2mm、处理温度＜40℃和诱变时间90s。作为优选，所述建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株具体为：1)对突变菌株库中的啤酒酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；2)对细胞悬浮液进行ARTP诱变处理，得到诱变菌液；3)将诱变菌液分别涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，进行恒温培养，挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化；4)分别吸取适量驯化菌液重复上述步骤2)-3)至少2-6轮，且提高每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度，将最终驯化菌液分别涂布于两种平板上，得到初筛菌株。作为优选，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-48h；菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×104-1×108个/mL。作为优选，所述步骤2)中，细胞悬浮液的取用量为1-20μL；ARTP诱变处理条件为：氦气流速5-45L/min、输入功率70-120W、处理距离1-4mm、处理温度低于60℃和诱变时间30-180s。作为优选，所述步骤3)中，所述诱变菌液的吸取量为5-200μL；所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为1-5d；所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为1-5d。作为优选，以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标，选择三种酶活力正突变幅度总和大于65％的初筛菌株作为复筛菌株。作为优选，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。作为优选，所得低产乙醛啤酒酵母的乙醛产量降低50％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒酵母菌株无显著差异。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术采用啤酒工业酵母作为出发菌株，经多轮ARTP诱变育种技术构建突变菌株库，利用乙醇-双硫仑抗性平板、高浓度乙醛筛选平板及其对应驯养液完成菌株的平板筛选及驯化，形成诱变-筛选-驯化的多轮初筛体系；同时以关键酶活性变化为低产乙醛复筛标准，通过实验室摇瓶水平的啤酒模拟酿造体系，最终获得乙醛降幅在50％以上的突变菌株，且突变菌株发酵液的主体风味与出发菌株无显著差异。本专利技术是对生产菌株的进一步优化和改进，具有应用于啤酒工业生产的潜能。附图说明图1为本专利技术实施例提供的诱变条件确立时菌株致死率与诱变时间的函数关系图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，包括以下步骤：对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。在上述方案中，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：将培养至对数中期的菌体以含有5％甘油的无菌生理盐水离心洗涤3次，稀释菌体量为1×106个/mL。取10μL菌悬液于无菌金属载片(8mm)，以氦气等离子束对酵母细胞进行诱变处理。ARTP诱变处理条件：保持氦气流速QHe＝15.0L/min，输入功率100W，处理距离2mm，处理温度＜40℃，诱变时间为90s。将金属载片置于1mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤。可以理解的是，上述诱变处理时，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：/n对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；/n利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；/n对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。/n

【技术特征摘要】
1.低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；
利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；
对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。


2.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：
将培养至对数中期的菌体稀释至1×106个/mL，利用氦气离子束对酵母细胞进行ARTP诱变处理。


3.根据权利要求2所述的高效选育方法，其特征在于，所述ARTP诱变处理的条件为：
氦气流速15.0L/min、输入功率100W、处理距离2mm、处理温度＜40℃和诱变时间90s。


4.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，所述建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株具体为：
1)对突变菌株库中的啤酒酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；
2)对细胞悬浮液进行ARTP诱变处理，得到诱变菌液；
3)将诱变菌液分别涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，进行恒温培养，挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化；
4)分别吸取适量驯化菌液重复上述步骤2)-3)至少2-6轮，且提高每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度，将最终驯化菌液分别涂布于两种平板上，得到初筛菌株。


5.根据权利要求4所述的高效选育方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐楠，赵鑫锐，尹花，李江华，陈坚，余俊红，堵国成，孙可澄，侯晓平，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37