一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，所述方法包括：菌种活化的步骤；常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变的步骤；松弛培养的步骤；多重压力培养的步骤；其中，所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。本发明专利技术的方法中采用常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变，并采用松弛培养与碘乙酸和丙二酸双压力结合进行筛选，增加菌株的突变率以及正突变率，增加得到高产菌株的概率，进而得到遗传稳定性量好的高产菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法。
技术介绍
槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，虽然有多种微生物能够合成槐糖脂，但Candidabombicola是研究报道中最主要的生产菌。槐糖脂在工业生产和科学研究中备受关注，由于它对环境无害，被认为是最有前途的生物活性剂之一。由于槐糖脂本身的特性，在发酵生产过程中高耗氧粘度大，导致生产成本增加，因此筛选出高产的槐糖脂生产菌株就很有必要。理性的基因工程育种方法是菌株改良的有利方法，但其主要有以下几个缺点：(1)细胞代谢是一个非常复杂的自适应网络，改变一两个基因可能无法达到要求的目标；(2)一些基因工程菌株相关产品的生产销售受到相关应用领域的限制。因此，传统诱变育种仍然是一种不可或缺获得优良性能生产菌株的方法，同时结合高通量筛选技术的快速发展，使得高性能菌株的可获得性大大提升。传统诱变方式一般分为物理诱变和化学诱变，物理诱变包括：紫外诱变、各种射线的辐射以及微波辐射等。化学诱变包括：亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、芥子气类以及核酸碱基类似物类等的化学诱变剂。Hafez等采用物理化学的诱变方法，使灰链霉菌E44G生产几丁质的酶活提高了1.39倍。而大气室温等离子体(ARTP)是一种基于射频大气压发光放电等离子体的新开发的全细胞诱变工具，诱导的DNA损伤随后被SOS系统修复，导致DNA改变，操作便捷、安全。在诱变的过程中，诱变是手段，筛选是关键，合理的筛选模型为最终得到高产菌提供了方便。在菌株诱变的过程中，单一诱变方法的使用会使得诱变剂产生“疲劳效应”，代谢缓慢等；且单一诱变筛选出的菌株比较容易退化。一般传统的筛选流程多是把经过单一诱变后的菌株直接涂布在有压力的平板上。在传统的高通量筛选方法中，如周刚等的研究结果中可以看出传统的诱变方法得到的菌株生长缓慢且容易退化，筛选效率不高；周刚等在高通量筛选的过程中只采用了单一的筛选压力，最终得到的高产菌株在实际发酵的过程中较易退化。因此，亟需提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，以增加菌株的突变率以及正突变率，增加得到高产菌株的概率，得到遗传稳定性量好的高产菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，将ARTP诱变与亚硝酸钠形成组合诱变，并且引入松弛培养，组合压力培养筛选，能够有效提高菌株正突变率，提高筛选过程中正突变菌株的概率。为了实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案。本专利技术提供了一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，所述方法包括：菌种活化的步骤；常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤；松弛培养的步骤；多重压力培养的步骤；其中，所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。进一步，所述亚硝酸钠与所述ARTP组合诱变的总致死率为88～92％。进一步，所述亚硝酸钠与所述ARTP组合诱变的总致死率90％。进一步，所述菌种活化的步骤包括：取甘油管菌种接到活化培养基中，在220r/min、25℃摇瓶培养48h，以活化菌种，稀释使菌种浓度为107个/ml，得到活化菌液。进一步，所述常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤包括：将所述活化菌液和亚硝酸钠溶液混合，得到5mg/L的亚硝酸钠的混合菌液，后置于220r/min、25℃培养10min，洗涤重悬，稀释，取适量菌液涂布并在ARTP仪器上诱变18～20s。进一步，所述松弛培养的步骤包括：将组合诱变后的菌液接种到不含压力的96孔板种子培养基中进行松弛培养48h。进一步，所述多重压力培养的步骤包括：将松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存；其中，所述96孔板和所述24孔板中均添加了含0.02g/L的碘乙酸的孔板种子液体压力培养基；所述固体平板中添加有含有10g/L的丙二酸的固体压力培养基。进一步，所述多重压力培养的步骤包括：将松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到两个24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到一个24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的5株菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存。进一步，所述高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法还包括初筛的步骤；所述初筛的步骤包括：将所述挑选菌落较大的菌株转接到96孔板中无压力培养两天，后转接到24孔板无压力发酵培养基中培养三天，用碘法测定孔板中槐糖脂产量，选取槐糖脂产量较高的菌株。进一步，所述活化培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆。进一步，所述孔板种子培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆。进一步，所述孔板种子液体压力培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆。进一步，所述固体压力培养基包括：20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L琼脂；pH自然。本专利技术中，所述摇瓶发酵可采用常规方法进行培养。本专利技术一具体实施例中，ARTP亚硝酸钠组合诱变的正突变率可以采用如下方法获得：将活化后的种子首先用合适浓度的亚硝酸钠处理，之后用无菌水重悬进行ARTP诱变；将诱变后的菌液稀释合适的倍数进行涂板，培养三天后挑选较大的单菌落接入96种子空板中进行培养两天，而后转接到24孔板发酵培养三天，结束后检测；计算ARTP亚硝酸钠组合诱变的正突变率。本专利技术一具体实施例中，所使用的培养基可以采用常规培养基。例如，采用下列摇瓶发酵培养基、孔板发酵培养基和发酵培养基：摇瓶发酵培养基包括：150g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆、6g/L的CaCO3、50g/L菜籽油；孔板发酵培养基包括：150g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆、6g/L的CaCO3、50g/L三油酸甘油酯；发酵培养基包括：100g/L葡萄糖、1g/L的KH2PO4、4g/L的(NH4)2SO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、10g/L玉米浆10；灭菌时把葡萄糖液称到500g。本专利技术中，突变率(QM)以及正突变率(QT)的计算公式如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述方法包括：/n菌种活化的步骤；/n常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变的步骤；/n松弛培养的步骤；/n多重压力培养的步骤；/n其中，所述菌种为假丝酵母菌；/n所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述方法包括：
菌种活化的步骤；
常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变的步骤；
松弛培养的步骤；
多重压力培养的步骤；
其中，所述菌种为假丝酵母菌；
所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。


2.根据权利要求1所述的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述亚硝酸钠与所述常压室温等离子体组合诱变的总致死率为88～92％。


3.根据权利要求1或2所述的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述菌种活化的步骤包括：取甘油管菌种接到活化培养基中，在220r/min、25℃摇瓶培养48h，以活化菌种，稀释使菌种浓度为107个/ml，得到活化菌液。


4.根据权利要求1或2所述的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变的步骤包括：将所述活化菌液和亚硝酸钠溶液混合，得到5mg/L的亚硝酸钠的混合菌液，后置于220r/min、25℃培养10min，洗涤重悬，稀释，取菌液涂布并在ARTP仪器上诱变18～20s。


5.根据权利要求1所述的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述松弛培养的步骤包括：将组合诱变后的菌液接种到孔板种子培养基中进行松弛培养48h。


6.根据权利要求1所述的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，其特征在于，所述多重压力培养的步骤包括：将松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：储炬，李前会，田锡炜，杭海峰，夏建业，庄英萍，李璟曦，张嘉兴，韩思宇，徐文静，杨露露，
申请(专利权)人：华东理工大学，华东理工大学青岛创新研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31