一种N糖基转移酶突变体F13及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种N糖基转移酶突变体F13，是对来源于胸膜肺炎放线杆菌中的N‑糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了所述突变体F13作为多肽糖基化修饰的工具酶将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。本发明专利技术的突变体F13相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段例如IgG片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP‑GlcA，可以实现简单快速的利用UDP‑Glc/UDP‑Gal/UDP‑GlcA将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化修饰，并可进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便方法。

【技术实现步骤摘要】
一种N糖基转移酶突变体F13及其应用
本专利技术涉及一种糖基转移酶及其应用，尤其涉及一种来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶的突变体(命名为F13)及其应用，属于分子生物学中糖工程

技术介绍
蛋白质的糖基化修饰对蛋白质的功能和理化性质影响极大，大部分抗体及细胞因子是N-糖基化的。抑制蛋白的糖基化往往影响蛋白正确折叠、代谢和蛋白的功能。也有研究发现将糖与载体蛋白相结合，形成的糖蛋白疫苗可以刺激机体产生免疫记忆，因此糖蛋白疫苗的研究引起了广泛关注。而糖蛋白的获得以往是通过生物体内直接提取，或者是体外进行化学合成，这两种方法均存在步骤繁杂，成本较高的缺点。已经报道的胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)来源的NGT能够直接利用游离的UDP-Glc和UDP-Gal糖基化具有N-X-S/T(X≠Pro)序列的多肽，步骤简单，成本较低，但是野生型NGT并不能糖基化所有具有N-X-S/T(X≠Pro)序列多肽，例如IgG的Fc片段，并且不能利用UDP-GlcA作为糖供体。目前已报道的ApNGT的突变中糖基化效率得到了提升，但是尚未报道能够糖基化IgG的Fc片段的突变体以及能够利用UDP-GlcA作为供体的N-糖基转移酶及突变体。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N糖基转移酶突变体及其在对多肽进行N连接糖基化修饰中的应用。本专利技术所述的种N糖基转移酶突变体，是对NCBIReferenceSequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N糖基转移酶突变体F13，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该突变体相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP-GlcA。上述N糖基转移酶突变体F13是通过将野生型N糖基转移酶(NCBIReferenceSequence:WP_005605627.1)胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因构建于载体pET45b上，利用诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C25-01)构建突变F13(N471I、S275A、P497R三点突变)，经过生工生物工程股份有限公司测序正确后，通过大肠杆菌BL21发酵诱导表达、纯化回收获得。本专利技术所述N糖基转移酶突变体F13在对多肽进行N连接糖基化修饰中的应用。进一步的，本专利技术所述N糖基转移酶突变体F13作为体内多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-GlcA将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。其中：所述N糖基转移酶突变体F13作为工具酶相较野生型NGT糖基化效率和底物识别范围显著提升，能将UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-GlcA上的Glc/Gal/GlcA转移至广泛的含N-X-S/T序列的多肽，形成糖肽；进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰能用于生产带有糖基化修饰的药物蛋白或目的糖肽。其中：上述药物蛋白优选是抗体、细胞因子或糖蛋白疫苗。本专利技术公开的N糖基转移酶突变体F13属于N-糖基化修饰的一种重要的糖基转移酶，其与野生型ApNGT相比不仅糖基化效率显著提升，而且可以糖基化野生型ApNGT不能够糖基化的肽底物例如血凝素片段和IgG片段，并且可以利用UDP-GlcA作为糖供体。在生产带有Glc/Gal/GlcA的糖肽后，进一步可以利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰，从而获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法。附图说明图1：F13蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。其中：M表示蛋白Maker，F13分子量大约在70KDa左右。图2：野生型ApNGT和F13突变体对HWM片段酶活结果图。供体为UDP-Glc，底物562.24，产物643.27，其中：a.ApNGT；b.F13突变体。图3：野生型ApNGT和F13突变体对二甲酰肽酶片段酶活结果图。供体为UDP-Glc，底物731.31，产物812.33其中：a.ApNGT；b.F13突变体。图4：野生型ApNGT和F13突变体对血凝素片段酶活结果图。供体为UDP-Glc，底物751.86，产物832.89。其中：a.ApNGT；b.F13突变体。图5：野生型ApNGT和F13突变体对IgG片段酶活结果图。供体为UDP-Glc，底物为544.27和544.60([M+3H)/3)及815.90和816.40([M+3H]/3)。其中：a.ApNGT；b.F13突变体。图6：F13突变体利用UDP-GlcA酶活结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本
技术实现思路
进行详细说明。如下所述例子仅是本专利技术的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本专利技术，并非对本专利技术作任何形式上的限制，凡是依据本专利技术的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本专利技术技术方案的范围内。下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中所涉及的试剂和耗材来源见表1。表1实施例所涉及的试剂和耗材来源明细实施例1：N糖基转移酶ApNGT突变体F13的构建及F13蛋白的表达与纯化和鉴定1、表达菌株的构建前期通过大量构建NGT定点突变菌株并筛选到了突变体F13。野生型N糖基转移酶(NCBIReferenceSequence:WP_005605627.1)胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因由南京金斯瑞公司合成并构建于载体pET45b上，其商品化菌株为DH5α-pET45b-ApNGT菌株。使用DH5α-pET45b-ApNGT菌株，提前用含0.1mg/mL的LB液体培养基170rpm，37℃培养DH5α-pET45b-ApNGT菌株至OD600达到0.6，并提质粒作为模板。按照诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C25-01)说明书，结合诺唯赞在线设计引物程CEDesign设计诱变引物(见表2)。对来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因的N471I、S275A、P497R三点突变，获得N-糖基转移酶的突变体。表2：构建F13突变体所需要的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种N糖基转移酶突变体，是对NCBI Reference Sequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N糖基转移酶突变体F13，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP-GlcA。/n

【技术特征摘要】
1.一种N糖基转移酶突变体，是对NCBIReferenceSequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N糖基转移酶突变体F13，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该突变体相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP-GlcA。


2.权利要求1所述N糖基转移酶突变体作为体内多肽糖基化修饰的工具酶在利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，李昆，刘昭曦，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37