一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用，试剂盒包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉。本发明专利技术干细胞外泌体冻干粉由干细胞提取液干燥得到，采用生理盐水诱导干细胞制备提取液，成份多样富含多种干细胞外泌细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，复合组分培养子宫内膜细胞可以取得预料不到的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用
本专利技术属于生物技术，具体涉及一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒及应用。
技术介绍
研究认为，子宫内膜细胞数量下降或者功能低下，将导致子宫内膜菲薄(子宫内膜厚度<7mm)或者子宫内膜功能失调，从而影响胚胎着床（SchwabKE,GargettCE.Co-expressionoftwoperivascularcellmarkersisolatesmesenchymalstem-likecellsfromhumanendometrium）。子宫内膜损伤病因包括，产后刮宫术、自发性流产、人工流产、子宫内膜消融术和盆腔结核、感染等导致的子宫内膜基底层和子宫肌层的破坏，研究认为，当损伤到子宫内膜基底层时，可能导致子宫内膜细胞的丢失或损伤。现有技术将原代干细胞接种于培养基中，原代培养，隔天换液，当原代干细胞生长至80～90%时，去除培养基，剩余的干细胞经过漂洗后与生理盐水混合，诱导培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤后，得到干细胞提取液；进一步公开了干细胞提取液含有丰富的细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，可以直接作为药物制剂，或者冻干后与辅料混合配置药物。但是该现有技术未涉及干细胞提取液与常规培养基组合，也没有公开组合后的培养体系对细胞培养的影响。
技术实现思路
本专利技术在现有干细胞提取液的基础上，公开了一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒、培养体系及应用。本专利技术采用如下技术方案：一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉；进一步的，本专利技术基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒由DMEM/F12培养基、白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、水组成。本专利技术中，采用生理盐水诱导制备提取液，成份多样富含多种干细胞外泌细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，复合组分培养子宫内膜细胞可以取得预料不到的技术效果。具体的，本专利技术干细胞外泌体冻干粉为现有产品，由干细胞提取液干燥得到，参见本专利技术申请人之前公开的CN111759866A。本专利技术中，水为超纯水。本专利技术中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基的3～6%，优选为4～5%，最优选5%；干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为1～10mg∶100mL，优选为3～7mg∶100mL，最优选5mg∶100mL；干细胞外泌体冻干粉、水的用量比例为1～10mg∶5mL，优选为4～6mg∶5mL，最优选5mg∶5mL。细胞培养过程复杂，现有技术都以基础培养基为必要成分，添加合适的添加剂，期望获得好的增殖效果。现有技术从子宫内膜组织得到细胞，在培养基中加入不同浓度的IL-8和IFN-α2b，对腺上皮细胞进行培养24小时后用MTT法检测细胞增殖的状况。同时，用含有IL-8的培养基对内膜细胞进行培养，24小时后用透射电镜观察IL-8对腺上皮细胞和间质细胞的影响。发现细胞的增殖与IL-8的含量有着明显的剂量依赖关系，并且在IL-8浓度为10ng/mL时最为显著。电镜观察发现在1ng/ml的IL-8的作用下，内膜细胞功能活跃，分泌旺盛，可见细胞外有胶原产生。而IFN-α2b对腺上皮细胞的增殖却有明显的抑制作用，因此IFN-α2b与IL-8对内膜细胞有影响。现有技术采用组织消化法分离单克隆贴壁生长的子宫内膜细胞，能够获得纯化的子宫内膜干细胞，并能在成骨诱导培养基及平滑肌诱导培养基的诱导下，成功向成骨细胞和平滑肌细胞分化。用CCK-8法测定子宫内膜细胞增殖活性，并绘制生长曲线图，生长曲线均呈类S形，在前2天生长速度平缓，在4-7天细胞增殖速度加快，处于指数生长期，到9-12细胞增殖速度再次变为平缓，处于平台期，细胞数相对稳定。本专利技术首次将先前研发的干细胞提取液冻干粉用纯水稀释溶解作为添加组成，与基础培养基、白蛋白一起组成培养体系，无需其他试剂或者细胞因子等加入，限定各组分比例，用于培养子宫内膜细胞，细胞生长过程中，可以贴壁生长，培养7天即可达到80～90%的生长密度，达到传代要求，并且经过CCK-8法测定子宫内膜细胞具有好的增殖活性。附图说明图1为实验组培养7天后细胞图；图2为对照组培养7天后细胞图；图3为空白组培养7天后细胞图。具体实施方式本专利技术从子宫内膜组织酶解消化得到子宫内膜细胞，再用由DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水混合组成的培养体系培养，得到增殖活性好的子宫内膜细胞。子宫内膜组织来源于医院，已经使用0.9%生理盐水清洗，在常规保存液中存放，不同人体来源不影响子宫内膜细胞的培养；子宫内膜细胞用于自体细胞移植，改善自体子宫内膜功能用。参见CN111759866A，将原代人脐带间充质干细胞按细胞密度106个/T150瓶，在无血清MSC培养基（ScienCell公司）中进行接种，然后于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，隔天换液；细胞生长密度接近90%时，使用一次性10mL移液管，去除培养瓶中培养基，每瓶加入20mL生理盐水漂洗，重复漂洗3次；再加入生理盐水（0.9%）25mL，不加入其他物质，诱导培养，在37℃、5%CO2的培养箱中进行诱导培养；诱导培养的时间72小时；然后1500rpm离心10分钟，收集上清液；将上清液过滤，滤膜为0.1微米，得到干细胞提取液溶液，然后真空冷冻干燥机进行冻干，得到干细胞外泌体冻干粉。真空冷冻干燥机进行冻干的过程如下：将干细胞提取液溶液分装西林瓶，5ml/瓶，-80℃预冻过夜；冻干机预冷3小时，降温至-55℃，放入样品；降低气压至800Pa，温度维持-55℃，时间2小时；降低气压至120Pa，温度升至-40℃，降压升温过程时间2小时；气压维持120Pa，温度维持-40℃，时间15小时；降低气压至100Pa，温度升至-35℃，降压升温过程时间2小时；气压维持100Pa，温度维持-35℃，时间5小时；气压维持100Pa，温度升至-25℃，升温过程时间1小时；气压维持100Pa，温度维持-25℃，时间2小时；气压维持100Pa，温度升至20℃，升温过程时间1小时；气压维持100Pa，温度维持20℃，时间2小时；气压维持100Pa，温度升至30℃；降低气压至10Pa，温度维持30℃，维持压力和温度时间2小时；恢复正常温度和气压，冻干结束，得到干细胞外泌体冻干粉。实施例一一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，由DMEM/F12培养基（Gibco）、人血白蛋白（杰特贝林）以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成，其中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的5%，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基、超纯水的用量分别为5mg、100mL、5mL。应用实施例采用实施例一的基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，将干细胞外泌体冻干粉加入超纯水中溶解，然后加入DMEM/F12培养基中，再加入人血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，包括DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉。


2.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，采用生理盐水诱导间充质干细胞制备提取液，再干燥得到干细胞外泌体冻干粉；水为超纯水。


3.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的3～6%。


4.根据权利要求3所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，白蛋白的体积为DMEM/F12培养基体积的4～5%。


5.根据权利要求1所述基于干细胞外泌体冻干粉的试剂盒，其特征在于，干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为1～10mg∶100mL；干细胞外泌体冻干粉、水的用量比例为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：董健伸，徐汝强，孙永沛，程洪斌，王晓东，孟凡江，
申请(专利权)人：博品上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31