SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF细胞中的应用技术

本发明专利技术公开了SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF细胞中的应用，将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂。本发明专利技术采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究。

【技术实现步骤摘要】
SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF细胞中的应用
本专利技术属于生物技术，具体涉及SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF中的应用。
技术介绍
脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性限制了其临床应用；间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中,它是一种具有多向分化潜能的细胞,具有促进组织再生的潜能。研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs,而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点，传统的化学消化法所分离获得基质血管片段(SVF)为细胞悬液,并非黏附在细胞外基质(ECM)上的生理状态,所以移植后ASCs易被宿主巨噬细胞吞噬,使成熟脂肪细胞和ASCs均不能长久成活,这是导致脂肪移植保留率不稳定的主要原因。现有技术公开了一种SVF提取用试剂盒，包括内身、盒套、副盒体和外盒。内身和盒套构成主盒体。内身的上端面上开设第一凹槽，在该第一凹槽的底面上开设一个离心管放置腔、两个过滤器放置腔、一个广口瓶放置腔及一个滴管放置腔；盒套由顶面、底面及宽度方向的两侧面构成，使内身从盒套的长度方向的任意一个敞开面能插入盒套的内腔；该盒套的顶面开设七个第一插孔和一个第二插孔，该盒套的底面开设七个第三插孔；副盒体的上端面开设第二凹槽，在该第二凹槽的底面上开设两个试剂瓶放置腔；外盒包括底盒和可开启的盒盖，使试剂盒保持密封状态；不仅便于携带仪器和试剂，更能方便临床医护人员对SVF进行提取。现有技术一般采用胶原酶溶解脂肪后离心过滤，对细胞活性有较大影响。
技术实现思路
本专利技术提供SVF提取试剂及其制备方法与在提取SVF中的应用，得到的SVF细胞存活率高，其中SVF可以称为基质血管成分，优选脂肪基质血管成分。本专利技术采用如下技术方案：SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。上述SVF提取试剂在提取SVF细胞中的应用。本专利技术中，SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到；SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%、透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L，优选的，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸的浓度为1g/L。本专利技术SVF提取试剂用于提取SVF细胞时，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。洗涤后的脂肪为现有技术，本专利技术的创造性在于提供新的SVF提取试剂，采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高；优选的，洗涤后的脂肪与SVF提取试剂的体积比为1∶1；消化为37℃消化1小时，进一步优选的，消化时振荡。本专利技术中，洗涤液为生理盐水；生理盐水一般为0.9%生理盐水。现有技术一般采用一种胶原酶或者再加入添加剂进行消化脂肪得到SVF细胞，存在胶原酶残留以及细胞过度消化的问题，尤其是加入白蛋白后，SVF细胞纯度不高；本专利技术采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性大、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究，比如关节炎药物的制备研究、软骨损伤药物的制备研究、美容药物的制备研究等。附图说明图1为本专利技术采集的脂肪图；图2为本专利技术脂肪酶解消化同样；图3为本专利技术实施例消化获得的SVF细胞；图4为本专利技术实施例获得SVF细胞直径分布图；图5为本专利技术实施例以及对比SVF细胞活性；图6为本专利技术实施例以及对比SVF细胞总数图；图7为本专利技术实施例获得SVF细胞活率；图8为本专利技术实施例获得SVF细胞活率；图9为本专利技术对比例获得SVF细胞-2活率；图10为本专利技术对比例获得SVF细胞-3活率；图11为本专利技术对比例获得SVF细胞-4活率；图12为本专利技术对比例获得SVF细胞-5活率。具体实施方式本专利技术的SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水组成。本专利技术将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，滤饼与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。涉及的原料为市售常规产品，具体的操作方法以及测试方法为本领域常规方法，制备在室温、常规条件下进行；使用Sigma公司胶原酶、默克公司的透明质酸。本专利技术实施例与对比例进行平行试验，除了SVF提取试剂的组成不同，其他条件都一样。实施例一将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸为1g/L。实施例二提取SVF细胞的方法，包括以下步骤：（1）将脂肪组织（腹部、如图1）加入PBS（pH7.2）中洗涤，静置分层后，吸除下层洗涤液，再洗涤至洗涤液无色，吸除下层洗涤液，得到洗涤后的脂肪；（2）将洗涤后的脂肪加入离心管中，再加入等体积的实施例一SVF提取试剂，于37℃振荡（80rpm）消化1小时，得到消化液，肉眼观察不到颗粒状物质，见图2；（3）将消化液500g离心5分钟，然后去除上层脂质，剩余部分加入5倍体积的生理盐水，然后过滤（80μm滤膜），滤饼加入生理盐水中，然后300g离心3分钟，去除上清液，得到SVF细胞-1，见图3，图4为其粒径分布（细胞计数仪），可以看出本专利技术得到的SVF细胞中，脂肪干细胞比例很高。对比例将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%。然后按照实施例二提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-2。将胶原酶Ⅰ加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.3%。然后按照实施例二提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-3。将胶原酶Ⅰ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.3%、透明质酸为1g/L。然后按照实施例二提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-4。将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、人血白蛋白加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、人血白蛋白的质量浓度为1%。然后按照实施例二提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-5。将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。/n

【技术特征摘要】
1.SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。


2.根据权利要求1所述SVF提取试剂，其特征在于，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%。


3.根据权利要求1所述SVF提取试剂，其特征在于，胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%。


4.根据权利要求1所述SVF提取试剂，其特征在于，胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%。


5.根据权利要求1所述SVF提取试剂，其特征在于，透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L。


6.根据权利要求1所述SVF提取试剂，其特征在于，S...

【专利技术属性】
技术研发人员：董健伸，徐汝强，孙永沛，程洪斌，王晓东，徐俊，顾非凡，高振宇，
申请(专利权)人：博品上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31