一种培养子宫内膜细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种培养子宫内膜细胞的方法，将干细胞外泌体冻干粉水溶液、人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，得到细胞培养体系；将子宫内膜组织分离得到的子宫内膜细胞用DMEM/F12培养基重悬后加入所述细胞培养体系，然后离心分离，取沉淀用所述细胞培养体系重悬，再接种培养瓶进行培养，完成子宫内膜细胞的培养。根据本发明专利技术的方法，细胞生长到第7天，细胞密度达到90%，可以进行细胞传代，且细胞活力好。

【技术实现步骤摘要】
一种培养子宫内膜细胞的方法
本专利技术属于生物技术，具体涉及一种培养子宫内膜细胞的方法。
技术介绍
子宫内膜由单层柱状上皮和固有层组成，子宫内膜损伤病因包括，产后刮宫术、自发性流产、人工流产、子宫内膜消融术和盆腔结核、感染等导致的子宫内膜基底层和子宫肌层的破坏，研究认为，当损伤到子宫内膜基底层时，可能导致子宫内膜细胞的丢失或损伤。现有技术能够有效的从组织中分离出细胞，然后进行培养，再回输自体，实现损伤修复，另外，还可以培养后的细胞为对象，检测抗原（EMAg），减少人体取材。细胞培养过程复杂，现有技术都以基础培养基为必要成分，添加合适的添加剂，期望获得好的增殖效果。现有技术从子宫内膜组织得到细胞，在培养基中加入不同浓度的IL-8和IFN-α2b，对腺上皮细胞进行培养24小时后用MTT法检测细胞增殖的状况。同时，用含有IL-8的培养基对内膜细胞进行培养，24小时后用透射电镜观察IL-8对腺上皮细胞和间质细胞的影响。发现细胞的增殖与IL-8的含量有着明显的剂量依赖关系，并且在IL-8浓度为10ng/mL时最为显著。电镜观察发现在1ng/ml的IL-8的作用下，内膜细胞功能活跃，分泌旺盛，可见细胞外有胶原产生。而IFN-α2b对腺上皮细胞的增殖却有明显的抑制作用，因此IFN-α2b与IL-8对内膜细胞有影响。众所周知，培养方法对细胞能够传代以及活力大小有决定关系，现有技术一般采用基础培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素作为培养体系，细胞密度达到80%可传代，但是依然存在长缓慢及传代效果不良等诸多问题（MolHumReprod，2013，19（6）：361-368）。
技术实现思路
本专利技术公开了一种培养子宫内膜细胞的方法，组成简单，经过7天的培养，得到的细胞活力强，可传代。本专利技术采用如下技术方案：一种培养子宫内膜细胞的方法，包括以下步骤：（1）将干细胞外泌体冻干粉水溶液、人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，得到细胞培养体系；（2）将子宫内膜组织分离得到的子宫内膜细胞用DMEM/F12培养基重悬后加入所述细胞培养体系，然后离心分离，取沉淀用所述细胞培养体系重悬，再接种培养瓶进行培养，完成子宫内膜细胞的培养。作为常识人子宫内膜组织常规在保存液中保存。本专利技术中，子宫内膜组织分离得到子宫内膜细胞的步骤为，取人子宫内膜组织离心分离，吸出上层保存液，再加入DMEM/F12培养基、胶原酶工作液，消化得到消化液；滤网过滤消化液，再将滤液离心，弃上清，得到子宫内膜细胞。本专利技术中，将干细胞外泌体冻干粉加入超纯水中得到干细胞外泌体冻干粉水溶液，干细胞外泌体冻干粉为现有产品，由干细胞提取液干燥得到，参见本专利技术申请人之前公开的CN111759866A，采用生理盐水诱导制备提取液，成份多样富含多种干细胞外泌细胞因子、细胞外基质、外泌体囊泡等，复合组分培养子宫内膜细胞可以取得预料不到的技术效果。本专利技术中，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基的3～6%，优选为4～5%，最优选5%；干细胞外泌体冻干粉、DMEM/F12培养基的用量比例为1～10mg∶100mL，优选为3～7mg∶100mL，最优选5mg∶100mL；干细胞外泌体冻干粉、水的用量比例为1～10mg∶5mL，优选为4～6mg∶5mL，最优选5mg∶5mL。本专利技术中，离心分离的参数为1000～2000转/分离心3～8分钟，优选1500转/分离心5分钟。接种培养瓶时，接种密度为103/cm2～105/cm2，优选104/cm2。本专利技术中，培养瓶为T150细胞培养瓶中，每个培养瓶加入20～30ml所述细胞培养体系，优选的，每个培养瓶加入25ml所述细胞培养体系。本专利技术中，培养的环境为37℃、5%CO2的培养箱；每3天更换一次所述细胞培养体系。作为优选的技术方案，本专利技术取人子宫内膜组织离心分离，吸出上层保存液，再加入DMEM/F12培养基、胶原酶工作液，消化得到消化液；滤网过滤消化液，再将滤液离心，弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬得到重悬液，再以体积比1∶（8～12）将重悬液加入所述细胞培养体系，然后离心分离，取沉淀用所述细胞培养体系重悬，再接种培养瓶进行培养，完成子宫内膜细胞的培养。本专利技术首次将先前研发的干细胞提取液冻干粉用纯水稀释溶解作为添加组成，与基础培养基、白蛋白一起组成培养体系，无需其他试剂或者细胞因子等加入，限定各组分比例，用于培养子宫内膜细胞，细胞生长过程中，可以贴壁生长，培养7天即可达到80～90%的生长密度，达到传代要求，并且经过CCK-8法测定子宫内膜细胞具有好的增殖活性。本专利技术以DMEM/F12培养基、人血白蛋白以及干细胞外泌体冻干粉、超纯水组成培养体系，首次用量培养子宫内膜细胞，意外发现培养7天即可传代，且细胞活力检测结果表明，培养的细胞活力好，说明本专利技术公开的试剂盒具有实际应用价值。附图说明图1为实施例一培养7天后细胞图；图2为对比例一培养7天后细胞图；图3为对比例二培养7天后细胞图；图4为实施例六培养7天后细胞图；图5为实施例七培养7天后细胞图；图6为实施例十培养7天后细胞图。具体实施方式参见CN111759866A，将原代人脐带间充质干细胞按细胞密度106个/T150瓶，在无血清MSC培养基（ScienCell公司）中进行接种，然后于37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，隔天换液；细胞生长密度接近90%时，使用一次性10mL移液管，去除培养瓶中培养基，每瓶加入20mL生理盐水漂洗，重复漂洗3次；再加入生理盐水（0.9%）25mL，不加入其他物质，诱导培养，在37℃、5%CO2的培养箱中进行诱导培养；诱导培养的时间72小时；然后1500rpm离心10分钟，收集上清液；将上清液过滤，滤膜为0.1微米，得到干细胞提取液溶液，然后真空冷冻干燥机进行冻干，得到干细胞外泌体冻干粉。真空冷冻干燥机进行冻干的过程如下：将干细胞提取液溶液分装西林瓶，5ml/瓶，-80℃预冻过夜；冻干机预冷3小时，降温至-55℃，放入样品；降低气压至800Pa，温度维持-55℃，时间2小时；降低气压至120Pa，温度升至-40℃，降压升温过程时间2小时；气压维持120Pa，温度维持-40℃，时间15小时；降低气压至100Pa，温度升至-35℃，降压升温过程时间2小时；气压维持100Pa，温度维持-35℃，时间5小时；气压维持100Pa，温度升至-25℃，升温过程时间1小时；气压维持100Pa，温度维持-25℃，时间2小时；气压维持100Pa，温度升至20℃，升温过程时间1小时；气压维持100Pa，温度维持20℃，时间2小时；气压维持100Pa，温度升至30℃；降低气压至10Pa，温度维持30℃，维持压力和温度时间2小时；恢复正常温度和气压，冻干结束，得到干细胞外泌体冻干粉。子宫内膜组织来源于医院，已经使用0.9%生理盐水清洗，在常规保存液中存放，不同人体来源不影响子宫内膜细胞的培养；子宫内膜细胞用于自体细胞移植，改善自体子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养子宫内膜细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将干细胞外泌体冻干粉水溶液、人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，得到细胞培养体系；/n（2）将子宫内膜组织分离得到的子宫内膜细胞用DMEM/F12培养基重悬后加入所述细胞培养体系，然后离心分离，取沉淀用所述细胞培养体系重悬，再接种培养瓶进行培养，完成子宫内膜细胞的培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养子宫内膜细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干细胞外泌体冻干粉水溶液、人血白蛋白加入DMEM/F12培养基中，得到细胞培养体系；
（2）将子宫内膜组织分离得到的子宫内膜细胞用DMEM/F12培养基重悬后加入所述细胞培养体系，然后离心分离，取沉淀用所述细胞培养体系重悬，再接种培养瓶进行培养，完成子宫内膜细胞的培养。


2.根据权利要求1所述培养子宫内膜细胞的方法，其特征在于，子宫内膜组织分离得到子宫内膜细胞的步骤为，取人子宫内膜组织离心分离，吸出上层保存液，再加入DMEM/F12培养基、胶原酶工作液，消化得到消化液；滤网过滤消化液，再将滤液离心，弃上清，得到子宫内膜细胞。


3.根据权利要求1所述培养子宫内膜细胞的方法，其特征在于，将干细胞外泌体冻干粉加入超纯水中得到干细胞外泌体冻干粉水溶液。


4.根据权利要求1所述培养子宫内膜细胞的方法，其特征在于，人血白蛋白的体积为DMEM/F12培养基的3～6%；干细胞外泌体冻干粉、DMEM...

【专利技术属性】
技术研发人员：董健伸，徐汝强，孙永沛，程洪斌，王晓东，孟凡江，
申请(专利权)人：博品上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31