一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针以及快速检测阿特拉津的方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测分析技术领域，涉及一种基于β‑环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针以及快速检测阿特拉津的方法。该探针由包括以下步骤的方法制得：(1)一步法合成环糊精修饰的金纳米颗粒：将缓冲液、氯金酸、β‑CD混合，剧烈搅拌后加热反应，得到环糊精修饰的金纳米颗粒β‑CD@AuNPs；(2)探针的制备：将步骤(1)得到的β‑CD@AuNPs与阿特拉津单克隆抗体混合，加入G‑四链体DNA链，得到所述生物条形码探针β‑CD@AuNPs@Ab@G4。本发明专利技术的方法在较短的时间内在β‑CD@AuNPs修饰抗体与DNA链制得生物条形码金纳米探针，相比于传统生物条形码探针的制备方法，此方法的时间缩短近五倍，且方法简单易行。

【技术实现步骤摘要】
一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针以及快速检测阿特拉津的方法
本专利技术属于食品安全检测分析
，具体地，涉及一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，以及一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针快速检测阿特拉津的方法。
技术介绍
阿特拉津(Atrazine，AT)是世界上一类最广泛在农业中使用的三嗪类除草剂。由于全球对粮食的需求逐渐增加，阿特拉津在农业上的使用不可避免，但是使用过程中增加粮食产量的同时也伴随环境污染的加剧，土壤中的阿特拉津最终会因为自然界的循环系统污染农作物与水体。一定浓度的阿特拉津对水生动物和人体的神经内分泌、生殖和发育产生影响，许多流行病学研究通过对饮用水的调查，统计学上表明阿特拉津有一定的致癌潜力。目前测定阿特拉津最常用的技术有气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和气相色谱质谱(GC-MS)。这些方法稳健、成熟，但样品前处理复杂耗时，设备昂贵，需要专业的技术人员，从而限制了其在实际分析中的广泛应用。生物条形码是一类新型的核酸信号放大检测技术，可用于核酸和蛋白质的检测，具有较高的灵敏度和特异性。生物条形码分析技术通常利用纳米材料修饰的大量核酸作为信号放大输出分子，常用纳米材料有金纳米颗粒、聚苯乙烯微球和其他球形纳米颗粒，磁性纳米粒子(MNP)用于分离与条形码信号结合形成的复合物。磁性分离收集信号完成后，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液释放DNA条形码，可以通过荧光、比色、电化学等多种方法进行检测。金纳米材料由于其高稳定性和生物相容性成为生物条形码检测中常用负载核酸信号的纳米材料。此外，AuNPs的表面化学是多种多样的，可以通过Au-SH或Au-N键结合或物理吸附连接各种生物功能基团(如糖、肽、脂类、蛋白质、核酸等)。传统的生物条形码检测中金纳米探针以Au-SH键偶联DNA条形码，偶联步骤繁琐且修饰时间较长。近年来，基于主客体作用的超分子识别得到了广泛的应用，β-环糊精(β-CD)是一类具有还原性的环状多糖物质，具有丰富的氨基和巯基基团。本专利技术中，借助环状空腔优异的主客体作用，可以实现抗体和DNA条形码探针的一步法偶联，大大提高偶联的效率和探针制备的稳定性。由血红素和DNAG-四链体形成的G-四链体DNA酶是一种具有类似过氧化物酶活性的核酸酶，能够有效地以H2O2为底物催化2,2′-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)或者鲁米诺。Red(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)是目前已知的用于HRP和H2O2的检测最灵敏、稳定的荧光探针。G-四链体与hemin的复合物可以催化AR染料发出荧光。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种检测阿特拉津的生物条形码探针及其制备方法，与传统生物条形码探针的制备相比，时间短，制备方法简单且稳定性较好，并且具有较高的灵敏度。为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，该探针由包括以下步骤的方法制得：(1)一步法合成环糊精修饰的金纳米颗粒：将缓冲液、氯金酸、β-CD混合，剧烈搅拌后加热反应，得到环糊精修饰的金纳米颗粒β-CD@AuNPs；(2)探针的制备：将步骤(1)得到的β-CD@AuNPs与阿特拉津单克隆抗体混合，加入G-四链体DNA链，得到所述生物条形码探针β-CD@AuNPs@Ab@G4。根据本专利技术，优选地，步骤(1)的方法包括：向圆底烧瓶中加入20～40mL超纯水，4～6mL0.08～0.12MpH7.0的PB缓冲液、0.8～1.2mL0.008-0.012M氯金酸和5～10mL0.04～0.06Mβ-CD，剧烈搅拌后，加热到95～100℃反应40～80min，待溶液由浅黄变为无色接着变成浅红，逐渐变为酒红色，表明金纳米颗粒逐渐成核形成；自然冷却至室温后，将上述溶液低温离心后用纯水重悬备用。根据本专利技术，优选地，步骤(1)的方法还包括：用BSPP进一步处理所述β-CD@AuNPs：将二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐加入到β-CD@AuNPs溶液后，垂直混悬反应，然后逐滴加入氯化钠溶液，当颜色从红色变成绿色时，离心去除上清液，用BSPP和甲醇重悬，重复离心操作后加入BSPP重悬。根据本专利技术，优选地，步骤(2)的方法包括：取200～400μLβ-CD@AuNPs，加入100-200μL用0.008-0.012MPBS稀释到5-15μg·ml-1的阿特拉津单克隆抗体，在4℃条件下温和混旋，加入0.4-0.6OD预先变复性处理的G-四链体DNA链，在4℃条件下继续温和混匀；然后将混合物在4℃条件下离心洗涤；最后用PBS缓冲液重悬。根据本专利技术一种具体实施方式，所述探针由包括以下步骤的方法制得：(1)一步法合成环糊精修饰的金纳米颗粒；向圆底烧瓶中加入20～40mL水溶液，5mLPB缓冲液(0.1M，pH7.0)，1mL氯金酸(0.01M)和5～10mlβ-CD(0.05M)，剧烈搅拌后，加热到100℃反应60min，可以看到溶液由浅黄变为无色接着变成浅红，逐渐变为酒红色，表明金纳米颗粒逐渐成核形成。自然冷却至室温后，取100ml上述溶液在4℃条件下10000rpm离心20min后用100mL纯水重悬备用。随后将5～10mg的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(增强了AuNPs体系的分散性与稳定性)加入到β-CD@AuNPs溶液(10nm，20mL)后，垂直混悬反应3d，然后逐滴加入5M的氯化钠溶液，当颜色从红色变成绿色的时候，1,600rcf离心30min后去除上清液，使用0.8mL的2.5mMBSPP和0.8mL甲醇。重悬结束后，重复离心操作后加入0.2mL2.5mM的BSPP。使用紫外可见分光光度于400～650nm的波长扫描，确定β-CD@AuNPs浓度(15nmAuNPs的摩尔消光系数为3.6×108cm-1M-1)。(2)金纳米探针的制备：取300μL经过BSPP处理过的β-CD@AuNPs，加入150μL用0.01MPBS稀释到10μg·mL-1的阿特拉津单克隆抗体，在4℃条件下温和混旋2小时，加入0.5OD预先90度变复性处理的G四链体(G-quadruplex)DNA链，在4℃条件下继续温和混匀3小时。然后将混合物在4℃条件下10000rpm离心20min，用PBS缓冲液洗涤3遍。最后用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)重悬至1mL。根据本专利技术，优选地，所述G-四链体DNA链的序列如SEQIDNO：1所示：5’-Pyrene-TTTTTTTTTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’(SEQIDNO：1)，其5’端修饰有芘基团。本专利技术还提供一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针快速检测阿特拉津的方法，该方法采用上述基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针进行，包括以下步骤：(1)室温条件下，取不同浓度的阿特拉津标准溶液与β-CD@AuNPs@Ab@G4混合，37℃条件下孵育，加入修饰有阿特拉津抗原的磁珠，37℃下振荡孵育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，其特征在于，该探针由包括以下步骤的方法制得：/n(1)一步法合成环糊精修饰的金纳米颗粒：/n将缓冲液、氯金酸、β-CD混合，剧烈搅拌后加热反应，得到环糊精修饰的金纳米颗粒β-CD@AuNPs；/n(2)探针的制备：/n将步骤(1)得到的β-CD@AuNPs与阿特拉津单克隆抗体混合，加入G-四链体DNA链，得到所述生物条形码探针β-CD@AuNPs@Ab@G4。/n

【技术特征摘要】
20210113 CN 20211004488891.一种基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，其特征在于，该探针由包括以下步骤的方法制得：
(1)一步法合成环糊精修饰的金纳米颗粒：
将缓冲液、氯金酸、β-CD混合，剧烈搅拌后加热反应，得到环糊精修饰的金纳米颗粒β-CD@AuNPs；
(2)探针的制备：
将步骤(1)得到的β-CD@AuNPs与阿特拉津单克隆抗体混合，加入G-四链体DNA链，得到所述生物条形码探针β-CD@AuNPs@Ab@G4。


2.根据权利要求1所述的基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，其中，步骤(1)的方法包括：向圆底烧瓶中加入20～40mL超纯水，4～6mL0.08～0.12MpH7.0的PB缓冲液、0.8～1.2mL0.008-0.012M氯金酸和5～10mL0.04～0.06Mβ-CD，剧烈搅拌后，加热到95～100℃反应40～80min，待溶液由浅黄变为无色接着变成浅红，逐渐变为酒红色，表明金纳米颗粒逐渐成核形成；自然冷却至室温后，将上述溶液低温离心后用纯水重悬备用。


3.根据权利要求1所述的基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，其中，步骤(1)的方法还包括：用BSPP进一步处理所述β-CD@AuNPs：
将二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐加入到β-CD@AuNPs溶液后，垂直混悬反应，然后逐滴加入氯化钠溶液，当颜色从红色变成绿色时，离心去除上清液，用BSPP和甲醇重悬，重复离心操作后加入BSPP重悬。


4.根据权利要求1所述的基于β-环糊精修饰的免疫生物条形码增敏探针，其中，步骤(2)的方法包括：
取200～400μLβ-CD@AuNPs，加入100-200μL用0.008-0.012MPBS稀释到5-15μg·ml-1的阿特拉津单克隆抗体，在4℃条件下温和混旋，加入0.4-0.6OD预先变复性处理的G-四链体DNA链，在4℃条件下继续温和混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江，高志贤，韩殿鹏，黄惠，霍冰洋，杜玉婉，秦康，彭媛，白家磊，宁保安，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12