基于pH梯度SPR的结合测定制造技术

本文报道了一种用于确定抗体与其抗原在解离pH值的解离速率常数k

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于pH梯度SPR的结合测定
本专利技术属于功能测定领域。本文报道了一种新颖的基于SPR的结合测定，用于测量抗体的pH依赖性相互作用。
技术介绍
SPR(表面等离子体共振)是一种基于生物传感器的技术，以测量实时蛋白质-蛋白质相互作用。SPR技术已成为生物制药研究和开发中的标准工具[1-5]，并且通常用于确定大分子相互作用的结合常数。确定分子相互作用的缔合和解离动力学的能力提供了对复合物形成机理的详细见解[6]。该信息正成为单克隆抗体和其他生物制药产品选择和优化过程的重要组成部分[7-10]。此外，SPR技术允许确定例如抗体结合靶标的结合活性(结合能力)。单一抗体分子的抗原中和能力取决于其亲和力。通过提高亲和力，可以用较少量的抗体中和抗原。可以使用多种方法来提高抗体亲和力。此外，如果通过将抗体与抗原共价结合可以使亲和力无限大，则单一抗体分子可以中和一个抗原分子(二价抗体可以中和两个抗原分子)。然而，由于一个抗体对一个抗原(一个二价抗体对两个抗原)的化学计量中和，不可能用比抗原量少的抗体量来完全中和抗原。为了将中和抗体的中和作用延长一定时间段，抗体的施用剂量必须高于同一时间段期间体内产生的抗原量。仅凭借抗体药代动力学或亲和力成熟技术的改进，所需抗体剂量的减少是有限的。因此，为了以比抗原量少的抗体量在目标时间段内维持抗体的抗原中和作用，单一抗体必须中和多个抗原。Shank-Retzlaff,M.L.和Sligar,S.G.公开了分析物梯度-表面等离子体共振作为确定动力学速率和大分子结合亲和力的一步法(Anal.Chem.72(2000)4212-4220)。US2005/0019933公开了表征液体环境中两种物质之间的相互作用的方法，其中包含所述至少一种物质的液体作为流而经过测量系统，并且其中相互作用发生在所述测量系统内。该方法包括产生至少一种所述物质或至少一种对相互作用或相互作用的组分具有影响的其他物质的浓度梯度。Schasfoort,R.B.M.等人在表面等离子体共振手册(2008年12月31日(2008-12-31)，第354-394页，剑桥)中公开了SPR技术的未来趋势。US2010/256338公开了包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体、尤其是双特异性抗体，它们的制备方法，含有这些抗体的药物组合物及其用途。WO2012/023053公开了对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体和制备对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体的方法。Schlothauer,T.等人公开了用于单克隆抗体功能表征的分析FcRn亲和色谱法(mAbs5(2013)576-586)。WO2015/140126公开了用于使用FcRn亲和色谱柱在不同盐浓度的存在下以正线性pH梯度洗脱来确定抗体-Fc-FcRn复合物中影响体内半衰期的抗体-Fab-FcRn相互作用的存在的方法。WO2015/172800公开了新型多特异性分子和基于此类多特异性分子的新型治疗方法。Meschendoerfer,W.等人公开了能够进行双特异性分子的全功能分析的基于SPR的测定(J.Pharm.Biomed.Anal.132(2016)141-147)。EP2275443公开了用于改善抗原结合分子的药代动力学的方法和用于增加抗原结合分子的抗原结合次数的方法，以及具有改善的药代动力学的抗原结合分子、具有增加的抗原结合次数的抗原结合分子和用于制备此类分子的方法。
技术实现思路
本文报道了一种新颖的基于SPR的测定，用于测量抗体的pH依赖性结合活性。如本文所报道的一个方面是一种用于确定(单克隆)抗体与其抗原的结合是否为pH依赖性(即抗体具有pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，其中如果在步骤b)中可以检测到抗体与固相的解离，则抗体与其抗原的结合是pH依赖性的。示出pH依赖性解离的示例性SPR传感图在图2中示出。如本文所报道的一个方面是一种用于选择与其抗原pH依赖性结合的(单克隆)抗体(即抗体具有pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，其中如果在步骤b)中可以检测到抗体与固相的解离，则选择该抗体。如本文所报道的一个方面是一种用于确定与其抗原pH依赖性结合的抗体与其抗原解离(pH依赖性解离)的pH值的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，其中抗体与其抗原解离的pH值是可以在步骤b)中检测到抗体与固相解离的pH梯度的pH值。本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体与其抗原的解离速率常数kd的测定或方法，其中抗体在解离pH值(解离pH值是可以检测到抗体与其抗原解离的pH值)与其抗原pH依赖性结合(pH依赖性解离)，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在解离pH值，c)记录(结合)信号并由此计算解离速率常数kd，从而确定在解离pH值的解离速率常数kd。示出在解离pH值解离的示例性SPR传感图在图3中示出。如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将单体抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，监测抗体与固相的解离，并因此计算解离速率，c)用二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体重复步骤a)至b)，其中如果步骤b)中计算的解离速率对于单体抗体和二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体相差超过10％，则抗体与其抗原的pH依赖性结合受寡聚化影响。如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗原寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的单体抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于确定抗体与其抗原在解离pH值的解离速率常数k

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181230 EP 18215921.01.一种用于确定抗体与其抗原在解离pH值的解离速率常数kd的表面等离子体共振方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在第一pH值将所述抗体固定在已缀合有所述抗体的所述抗原的固相上，
b)施加从所述第一pH值到所述解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在所述解离pH值，
c)在维持所述pH值期间记录结合信号，并由此计算所述抗体与其抗原在所述解离pH值的所述解离速率常数kd。


2.一种用于确定抗体与其抗原在解离pH值的解离速率常数kd的表面等离子体共振方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在第一pH值，使用与所述抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将所述抗体固定在固相上，
b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育以形成捕获的抗体-抗原复合物，
c)对所述固相施加从所述第一pH值到所述解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在所述解离pH值，
d)在维持所述pH值期间记录结合信号，并由此计算所述抗体与其抗原在所述解离pH值的所述解离速率常数kd。


3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述解离pH值以包括以下步骤的方法来确定：
i)在第一pH值将所述抗体固定在已缀合有所述抗体的所述抗原的固相上，
ii)对所述固相施加从所述第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测所述抗体与所述固相的解离，
其中所述抗体与其抗原解离的pH值是可以在步骤ii)中检测到所述抗体与所述固相解离的所述pH梯度的所述pH值。


4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述解离p...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·施洛特豪尔，C·斯皮克，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH